高压氧预处理对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

作者：卢培刚，冯华，王宪荣，杜鹏，夏勇智，宫国旗，李 梅    作者单位：中国人民解放军第三军医大学附属西南医院神经外科， 重庆 400038 　　【摘要】  目的 探讨高压氧预处理对急性脊髓损伤后不同时期神经细胞凋亡的影响及神经保护机制。 方法 将55只SD大鼠随机分为高压氧预处理组 （25只）、正常损伤组 （25只） 及对照组 （5只）。大鼠急性脊髓损伤模型制作采用改良Allen's法，分别于伤后1 d、5 d、7 d、10 d和14 d在脊髓损伤部位取材，应用苏木精-伊红染色、原位缺口末端标记 （TUNEL） 方法检测大鼠脊髓损伤后的神经细胞凋亡情况。 结果　 预处理组和单纯损伤组均见TUNEL阳性凋亡细胞，而预处理组凋亡细胞数减少；在各时间点预处理组与单纯损伤组差异均有统计学意义 （P ＜0.05）。 结论 高压氧预处理可减少继发性脊髓损伤细胞凋亡，因而可促进脊髓损伤后修复，对中枢神经系统损伤具有保护作用。

　　【关键词】  脊髓损伤； 高压氧； 预处理； 细胞凋亡

　　Effects of preconditioning with hyperbaric oxygen on neural cell apoptosis after acute spinal cord injury in rats

　　LU Peigang, FENG Hua, WANG Xianrong, et al.

　　Department of Neurosurgery, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　Abstract：  Objective  To study the effects of preconditioning with hyperbaric oxygen on neural cell apoptosis at different time periods and the mechanism of neuroprotection after acute spinal cord injury in rats.  Methods  Fifty-five adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: hyperbaric oxygen preconditioning group (n = 25), normal injury group (n = 25) and control group (n = 5). In the experimental groups, the spinal cord injury models were established by Allen's method. The samples were taken from the spinal cord injury sites at days 1, 5, 7, 10, 14 after the injury and tested by hematoxylin and eosin staining for morphology and by TUNEL method for cell apoptosis.  Results  The apoptotic cells positive of TUNEL were detectable in both two experimental groups. In the preconditioning group, the number of apoptotic cells was less and neuronal function of the spinal cord better as compared with those in the control group. There were statistically significant differences between the preconditioning group and normal injury group especially the control group (P < 0.05).  Conclusion  The hyperbaric oxygen preconditioning can reduce the number of apoptotic cells and promote the nerve function recovery in rats after spinal cord injury.

　　Key words: spinal cord injuries; hyperbaric oxygenation; preconditioning; apoptosis

　　脊髓损伤 （spinal cord injury，SCI） 时广泛存在神经元和胶质细胞凋亡[1]，防止SCI 后细胞凋亡，减轻继发性SCI，从而促进神经功能恢复，是SCI 的治疗策略之一。高压氧具有保护脊髓细胞和组织结构，延长损伤后神经细胞再生期，促进神经纤维再生的作用[2]。本实验对高压氧预处理组、正常损伤组及假手术对照组在SCI后不同时期细胞凋亡的情况进行对照研究，探讨高压氧预处理是否可以减少SCI后细胞凋亡，减轻继发性SCI，从而对SCI起到保护作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组  

　　成年 SD大鼠55 只，雌性，清洁级，体质量250～300 g，由第三军医大学动物实验中心提供。按SCI后不同时间点 （伤后1 d、5 d、7 d、10 d、14 d） 随机分为高压氧预处理组、正常损伤组及对照组，每组5只。高压氧预处理组实验动物置入GB-150型钢制实验动物高压舱内，纯氧加压致 0.02 MPa （表压） 洗舱10 min，然后在15 min内匀速加压至 2.5 ATA （0.15 MPa），稳压 90 min，中间用氧通风 5 min，舱内氧浓度为98%～100%，温度22 ℃，相对湿度 为60%～80%。治疗完毕用 15 min 匀速减压出舱，1次/d，共治疗 5 d。然后与正常损伤组同时造模。　　　　1.2 动物模型制作  

　　1%异戊巴比妥钠 （50 mg/kg） 腹腔注射麻醉，背部剃毛，常规消毒。以 T8为中心，纵行切开皮肤及皮下组织，剥离椎旁肌肉并暴露棘突与椎板，手术显微镜下咬除T8椎板，模仿Allen's法用自行加工设计的30 g冲击棒 （下端直径为3 mm） 自5 cm高处自由坠落致伤脊髓 （致伤能量为150 gcf）。缝合伤口，术后腹腔注射生理盐水5 ml补充液体，并给予青霉素20万U肌肉注射，2次/d × 3 d。协助大鼠排尿，每日早晚各 1次，持续1～2周，至大鼠恢复反射性排尿。观察皮肤有无压疮或感染，下肢有无溃烂。对照组大鼠仅切除相应椎板，即缝合伤口。动物饲养室温维持在25～30 ℃。

　　1.3 取材与标本制作  

　　各组大鼠在术后相应时间点麻醉后经左心室-主动脉插管，灌注生理盐水和4%多聚甲醛，完整取出脊髓，标本置入4%的多聚甲醛固定2～4 h，损伤段脊髓组织块石蜡包埋，连续切片，片厚10 μm。从每只大鼠的切片中随机抽取1张，作苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察不同损伤时间点各组SCI的形态学改变。按原位凋亡 （TUNEL） 检测试剂盒 （武汉博士德） 使用说明，对脊髓组织切片进行染色，在高倍光镜下，记录每张切片的阳性细胞数。

　　1.4    统计学处理  

　　采用SPSS10.0统计软件，对TUNEL在SCI不同时间点的免疫染色结果进行比较，所有数据采用均数 ± 标准差表示。三组间比较采用非配对t检验，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。

　　2  结 果

　　2.1 形态学改变 （图1）  

　　单纯损伤组：伤后1 d可见损伤段有广泛出血，脊髓结构严重破坏，大量神经元死亡，前角部分神经元尚存，Nissl体减少，其中部分神经元可见核固缩。白质中可见轴突肿胀和大量空泡；伤后5 d相邻节段损伤加重，灰白质中部分细胞形态改变；伤后7 d损伤范围确定，脊髓内空洞形成，周围炎性细胞浸润，大量胶质细胞增生；伤后10~14 d损伤中心形成一坏死空腔，范围固定，边缘区可见大量的胶质细胞群，白质区仍有部分正常结构。预处理组：伤后1 d损伤段结构破坏，神经元死亡，残存神经元数量较正常损伤组明显增多；伤后5 d损伤范围趋于固定，相邻节段损伤加重；伤后10~14 d周围出现明显的胶质细胞群，灰白质界限清晰，白质中有大量的正常轴突。

　　2.2 TUNEL标记及计数结果 （图2，表1）    　　SCI后单纯损伤组与预处理组均可观察到TUNEL标记的阳性凋亡细胞，具有典型的细胞凋亡特征性改变，凋亡细胞染色质固缩，呈斑块状聚集于核膜周边，胞浆浓染。伤后1 d阳性细胞主要见于脊髓灰质后角，伤后5 d阳性细胞在灰质和白质中均出现，伤后7~14 d 灰质的阳性细胞减少，阳性细胞主要在白质中，预处理组大鼠SCI后凋亡的阳性细胞数在各对应时间点明显低于单纯损伤组。

　　3 讨论        　　预处理作为神经保护的重要手段越来越受到重视，目前对于低氧预处理、缺血预处理对中枢神经缺血再灌注损伤保护作用的研究取得了很大的进展。低氧预处理是指机体预先经受一定程度短暂的低氧后，再恢复常氧状态，如此反复多次刺激使机体对低氧产生适应，从而提高机体对缺氧的耐受能力。药物预处理的研究也不断深入，但低氧缺血和药物预处理的不安全因素仍有待进一步研究。相比而言，高压氧预处理是安全可靠的，高压氧舱已在各级医院得到普及，为高压氧预处理的临床应用奠定了良好的基础。高压氧预处理为SCI的防治提供了新的思路和方法。        　　高压氧预处理的神经保护作用机制尚不明确，有实验表明：高压氧预处理作为一个预刺激，可能通过自由基的增多上调神经元抗氧化酶水平，提高神经元的抗氧化能力，从而增加其对随后氧化损伤的耐受性。细胞凋亡是急性SCI后神经细胞的主要死亡形式，也是加重SCI的一个因素。高压氧预处理是否可以作为一种细胞凋亡抑制因子来干预此过程，减轻继发性SCI，本实验目的即对此进行探讨。        　　SCI后继发于初级创伤的一系列神经生化、微循环失调形成的恶性病理连锁反应是造成永久性神经损害的主要原因。其中细胞凋亡可被兴奋性氨基酸、自由基、细胞因子、炎性因子触发，在神经细胞生长、发育、分化和再生过程中起重要作用[3]。这种死亡方式广泛存在于多种细胞的生理及病理过程中，并存在调控的可能性，因而成为当前研究的热点[4]。机械性SCI 后广泛存在神经细胞凋亡[5]，是迟发性SCI后神经细胞死亡的重要方式，SCI后24 h内细胞凋亡和坏死并存，24 h后以细胞凋亡为主，两者共同加重了中枢神经的损害。        　　高压氧可以提高血氧分压，增加血氧含量及氧弥散，迅速改善组织的缺氧状态，改善增强细胞线粒体酶的活性，促进细胞损伤修复和正常代谢[6]，可明显增加体内自由基的产生[7]，从而诱导脊髓缺血、缺氧耐受。高压氧还抑制活化小胶质细胞分泌产生某些细胞因子，从而调节了小胶质细胞介导的免疫反应[8]。本实验观察到，经高压氧预处理的神经元和胶质细胞在受到同样的创伤后，形态学变化轻微，神经元活存数量明显高于单纯损伤组。创伤早期，神经元死亡以坏死为主，表现为神经元肿胀、体积增大、胞膜破裂为主要特征，TUNEL 染色结果为阴性；伤后1~5 d，神经元死亡则以凋亡为主，表现为神经元表面皱缩、体积缩小、细胞核固缩或碎成数个圆形颗粒即凋亡小体，TUNEL染色为阳性，持续到伤后2周仍可见凋亡细胞，主要是少突胶质细胞。单纯损伤组，大鼠脊髓灰质和白质中的星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经元均发生了凋亡，TUNEL阳性细胞率较高，而高压氧预处理组细胞凋亡受到显著的抑制，TUNEL阳性细胞率处于较低水平，但至伤后14 d，高压氧预处理组与单纯损伤组之间的差异无统计学意义，说明高压氧预处理抑制神经细胞凋亡具有一定的时间窗限制。这一特性与低氧预适应有相似之处，即保护作用的时相性，在短暂的缺氧与后继的长时间缺血 （缺氧） 之间必须有一个再灌注的间隔，这一间隔的长短影响保护作用的效果，超过一定的阈值将使保护作用消失[9]。        　　本实验所建立的高压氧预处理动物模型，要求的实验设备简单，通过对增压高度的调节，易于控制。预处理对实验动物不造成明显损伤，动物置于同一高压氧舱中，可降低实验操作等人为因素对实验结果的影响，具有稳定性和可重复性。总之，本实验结果表明，高压氧预处理可使神经元和胶质细胞对继发性缺血、缺氧产生耐受，可减少SCI后神经细胞的凋亡；同时，这种保护作用具有一定的时间窗限制。

【参考文献】　　[1] CROWE M J, BRESNAHAN J C, SHUMAN S L, et al.Apoptosis and delayed degeneration after spinal cord injury in rats and monkeys [J]. Nat Med, 1997, 3(1): 73-76.

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　　[9] BERNAUDIN M, NEDELEC A S, DIVOUX D, et al. Normobaric hypoxia induces tolerance to focal permanent cerebral ischemia in association with an increased expres- sion of hypoxia-inducible factor-1 and its target genes, ery- thropoietin and VEGF, in the adult mouse brain [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2002, 22(4): 393-403.