蛋白酶体抑制剂诱导多巴胺能神经元变性及诱导型一氧化氮合酶变化

作者：曹刘，牛朝诗，梅加明，潘琪    作者单位：安徽医科大学附属省立医院神经外科 安徽省立体定向神经外科研究所， 安徽 合肥 230001 　　【摘要】  目的 探讨蛋白酶体 （proteasome） 功能下降在帕金森病 （PD） 发病机制中的作用，以及模型大鼠脑内黑质部位诱导型一氧化氮合酶 （iNOS） 是否参与蛋白酶体抑制剂Lactacystin诱导的多巴胺能神经元变性。方法 将30只健康雄性SD大鼠分为5组 （生理盐水对照组，1 d组、3 d组、1周组、3周组），每组6只。将蛋白酶体抑制剂Lactacystin立体定向注射至大鼠黑质部位，记录大鼠在不同时间点的行为学改变，并用免疫组化方法观察生理盐水对照组及不同时间点组 （1 d、3 d，1周、3周） 大鼠黑质区多巴胺能神经元变性及iNOS变化。 结果 Lactacystin注射1周后大鼠开始出现自发性活动减少，阿朴吗啡可诱导出旋转行为；3周后，30 min旋转次数为258.90 ± 11.56；实验3周组黑质部位TH阳性细胞减少。1 d后iNOS阳性细胞明显增多， 3 d时达高峰，1周后开始下降，3周时基本消失。结论 蛋白酶体功能下降可能是多巴胺能神经元变性的始动因素，而iNOS上调可能是多巴胺能神经元变性的重要过程。

　　【关键词】  帕金森病；蛋白酶抑制药；多巴胺；一氧化氮合酶；黑质

　　Degeneration of dopaminergic neurons and changes of inducible nitric oxide synthase induced by a proteasome inhibitor

　　CAO Liu, NIU Chaoshi, MEI Jiaming, et al.

　　Department of Neurosurgery, Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medial University, Anhui Provincial Institute of Stereotactic Neurosurgery, Hefei 230001, China

　　Abstract:  Objective  To investigate the role of proteasomal dysfunction in the pathogenesis of Parkinson disease and whether the changes of inducible nitric oxide synthase in the substantia nigra of model rats are involved in the degeneration of dopaminergic (DA) neurons induced by proteasome inhibitor lactacystin.  Methods  Thirty healthy SD male rats are equally divided into 5 groups (saline control and 1-day, 3-day, 1-week and 3-week groups). Lactacystin was stereotaxically infused unilaterally into the substantia nigra of the rats, and the behavioral alterations of rats at different time points were recorded. The degeneration of DA neurons and the changes of inducible nitric oxide synthase in the substantia nigra of all the groups were detected by immunohistochemistry.  Results  The rats presented with reduction of spontaneous activity and apomorphine-induced contralateral rotation on the 7th day after lactacystin injection. On the 21th day after the injection of lactacystin, the number of apomorphine-induced contralateral rotations in 30 minutes was 258.90±11.56. The number of TH-positive cells in the central nervous system was decreased significantly in the 3-week group. The numbers of iNOS positive cells in the central nervous system was increased dramatically after 1 day with lactacystin injection and peaked on the 3rd day, started to decrease on the 7th day and virtually disappeared at the 21th day.  Conclusion  The dysfunction of proteasome may play a trigger role in the pathogenesis of Parkinson disease. Up-regulation of iNOS may be one of the crucial mechanisms in Lactacystin-induced degeneration of DA neurons.

　　Key words:  parkinson disease;  protease inhibitors;  dopaminer;  nitric-oxide synthase;  substantia nigra

　　帕金森病 （Parkinson disease，PD） 的发病机制尚不清楚，多项研究结果表明：泛素－蛋白酶体系统 （ubiquitin－proteasome system，UPS) 功能下降、氧化应激和脑内炎症，可能在黑质区多巴胺能神经元变性过程中起重要作用。一氧化氮 （NO） 作为中枢神经系统内重要的神经毒性物质，通过多种途径参与了氧化应激、炎症等过程，而诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是NO生成的重要限速酶。本实验通过观察蛋白酶体被抑制后iNOS以及多巴胺能神经元的变化情况，分析三者间的关系，为进一步阐明PD的发病机制和选择临床治疗PD的新靶点提供依据。

　　1  材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物：  

　　健康雄性Sprague Dawley （SD） 大鼠30只，体质量200～250 g，行为测试无异常，适应性饲养1周，室温保持22～25 ℃，光线12 h明暗交替，自由饮水饮食。

　　1.1.2 实验试剂与器材：  

　　Lactacystin、阿扑吗啡、小鼠抗酪氨酸羟化酶 （TH） 单克隆抗体 （美国Sigma公司），iNOS多克隆抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒 （北京中杉公司），大鼠立体定向仪 （SR-6N型，日本Narishige公司）。

　　1.2 动物分组  

　　随机分为生理盐水对照组和4个不同时间点实验组 （1 d、3 d，1周、3周），每组6只。

　　1.3 黑质立体定向注射Lactacystin  

　　SD实验大鼠采用3.5%水合氯醛 （350 mg/kg） 腹腔注射麻醉后固定于立体定向仪。根据文献报道[1]选择左侧黑质致密部 （SNpc） （坐标：前囟后5.2 mm，矢状缝左侧2.2 mm，硬膜下7.2 mm） 注射2 μl Lactacystin （10 μg），给药速度为0.5 μl/min，留针5 min，缓慢退针，缝合切口，然后再肌注青霉素100 000 IU。对照组注入相同体积的生理盐水。

　　1.4 动物行为观察及阿朴吗啡诱导旋转实验  

　　干预后7 d、14 d、21 d观察大鼠行为改变，是否出现震颤、活动迟缓、抓握、嗅探等异常行为，并腹腔注射阿扑吗啡 （0.5 mg/kg），10 min后开始观察大鼠旋转行为的改变，记录30 min的旋转圈数。

　　1.5 免疫组织化学方法 （SP法）  

　　每组均行TH和iNOS免疫组织化学染色检测。灌流、固定、取材： 3.5%水合氯醛 （400 mg/kg） 深度麻醉大鼠。将大鼠固定于大鼠实验板上。剪开腹腔，从膈肌破入胸腔，充分暴露心脏，持14号针头从心尖部刺入左心室，剪开右心耳，快速灌注生理盐水，400～500 ml/只，直至从右心耳流出的液体变清及肝脏颜色变白，再将灌注液换成4%多聚甲醛300～400 ml，滴速先快后慢，灌注约20 min。内固定完成后，断头取脑，仔细观察鼠脑表面结构，对照大鼠脑定位图谱，取中脑组织；距额叶前端3 mm处向尾侧取4 mm厚脑组织。所取脑组织4%多聚甲醛后固定24 h。组织脱水、透明、浸蜡、包埋后，用石蜡切片机切片，片厚5 μm。免疫组化染色：①石蜡切片常规脱蜡至水。②3%双氧水室温孵育5～10 min，PBS冲洗5 min × 3次。③抗原修复：采用微波热修复。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液的容器中，置微波炉内加热至沸腾，断电10～15 min，再加热至沸腾后断电，自然冷却到室温，PBS冲洗5 min × 1次。④滴加封闭用正常山羊血清工作液室温孵育10～15 min，倾去。⑤滴加1 ∶ 500的小鼠抗TH或1 ∶ 100的兔抗iNOS一抗，37 ℃孵育1 h后4 ℃过夜。⑥PBS冲洗5 min × 3次，滴加生物素标记的抗小鼠或抗兔的二抗工作液，37 ℃孵育10～15 min。⑦PBS冲洗5 min × 3次，滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37 ℃孵育10～15 min。⑧PBS冲洗5 min × 3次，DAB镜下控制显色。必要时行苏木精复染。⑨自来水充分冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察。光镜下观察TH和iNOS表达情况，计数黑质区免疫阳性细胞数。

　　1.6 统计分析  

　　实验数据采用均数 ± 标准差表示，使用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，多组数据间比较采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

　　2  结 果 （图1，2）

　　2.1  大鼠行为学改变  

　　大鼠注射Lactacystin 1周后出现自发性活动减少，动作缓慢，震颤、对外界刺激不自主竖毛，症状逐步加重。注射阿扑吗啡后大鼠出现恒向健侧旋转，表现为以健侧后肢为支撑点，头尾相接，身体弯曲成环状的快速旋转行为。1周组、3周组的30 min的旋转次数分别为 （118.35 ± 9.45） 次和 （258.90 ± 11.56） 次。1 d组、3 d组和生理盐水对照组大鼠未观察到明显的行为改变，阿扑吗啡亦未能诱发出旋转行为。

　　2.2 黑质TH免疫组化染色结果 （图1）  

　　生理盐水对照组大鼠双侧黑质部位TH阳性细胞数量较多，分布较均匀，核大而圆，边缘清晰，细胞质浓染，突触清晰可见 （图1A）；注射Lactacystin后1 d组、3 d组及1周组，双侧黑质部位TH阳性细胞数量较多，分布较均匀，细胞形态与生理盐水对照组比较未见差异；注射Lactacystin后3周组，大鼠左侧黑质部位TH阳性细胞数量少，胞体皱缩，结构不清 （图1B）。给药后3周组与生理盐水对照组左侧黑质TH阳性细胞计数分别为61.17 ± 18.39和339.00 ± 39.38，两者比较，差异有统计学意义 （P ＜0.05）。

　　2.3 黑质iNOS免疫组化染色结果 （图2）  

　　生理盐水对照组实验大鼠的双侧黑质部位无阳性细胞；注射Lactacystin后1 d组、3 d组、1周组及3周组大鼠左侧黑质可见体积较小，胞体近圆形，细胞质和胞核均浓染的阳性细胞，细胞计数分别为47.50 ± 8.19、38.67 ± 6.15、8.83 ± 2.71及2.03 ± 0.12，与对照组比较，差异有统计学意义 （P ＜0.05）。

　　3 讨 论          　　PD病理特征为黑质致密部 （substantia nigra pars compacta，SNc） 多巴胺能神经元选择性、进行性丧失，及在残存神经元内出现Lewy小体[2-4]。        　　在PD的发病机制中，氧化应激、炎症、线粒体功能障碍以及谷氨酸兴奋性神经毒性反应等均起着不可忽视的作用，NO通过多种途径参与以上发病过程。NO是一种普遍存在的信号分子和扩散性神经递质，能够调节神经细胞的增生、分化和生存，尤其在调节突触功能和促进神经细胞可塑性方面发挥重要作用。当其作为神经递质时，影响其他神经递质的释放，调节神经内分泌系统，有助于控制心血管、呼吸和消化系统，并能维持基本的脑血管张力，调节脑血流，影响脑血流的自身调节，增强学习和长期记忆功能等[5]。但NO过量则表现出神经毒性，其机制为：①通过自由基和过氧化物阴离子反应产生细胞毒性物质过亚硝酸盐 （ONOO－），它是一种高度活化分子，能够氧化 （硝基化） 其他分子或产生更加有毒的活性氧物质，如羟基和NO2，这些活性氧类物质能引起剧烈的氧化应激反应；②与乌头酸水合酶及线粒体酶复合体Ⅰ和Ⅱ结合影响线粒体能量产生，导致线粒体功能障碍；③介导谷氨酸兴奋性神经毒性。        　　中枢神经系统通过左旋-精氨酸-NO途径产生NO，左旋-精氨酸与O2在一氧化氮合酶 （NOS） 作用下生成NO和其他产物。目前分子克隆和生物化学研究已经证实NOS有3个亚型：神经型 （nNOS）、内皮型 （eNOS） 以及诱导型 （iNOS）。其中nNOS和eNOS产生NO的过程具有负反馈机制，因而只能产生低浓度的NO；而iNOS无负反馈机制，能够产生大量NO[6]。多项研究已经证明iNOS参与了PD的发病过程。Hunot等[7]发现因PD死亡的病人，中脑部位的iNOS阳性胶质细胞明显高于正常对照组；Shibata等 [8]在用脂多糖 （LPS） 处理的体外小鼠中脑切片培养研究中发现iNOS抑制剂能够明显保护多巴胺能神经元等。近年PD发病机制的研究又有了巨大进展，发现泛素－蛋白酶体系统 （UPS） 功能障碍在PD发病中可能起着极其重要的作用。UPS是细胞内重要的非溶酶体性蛋白质降解系统，参与细胞内异常蛋白质的降解过程[9]，其中包括被氧化的蛋白质[10]，而研究表明PD病人黑质致密部内被氧化损坏的蛋白质含量显著升高[11]，这就是说，UPS积极参与这些异常蛋白的降解过程，维持细胞内环境的稳定。近年研究发现家族性PD的数个突变基因的表达产物均与泛素-蛋白酶体系统有关，包括α-共核蛋白、Parkin、泛素C端水解酶L1等[12]。McNaught等[13-15]发现散发性PD病人多巴胺能神经元内20S蛋白酶体α亚单位丢失，水解功能下降，而其他脑区无此变化；抑制蛋白酶体引起胎鼠中脑原代培养中选择性多巴胺能神经元退变，且伴细胞质内α-共核蛋白和泛素水平升高及两者免疫阳性包涵体形成。但目前对PD发病机制中各因素间关系的研究还比较少，Musial等[16]曾培养出稳定表达iNOS的细胞株，并通过蛋白酶体抑制剂进行干扰，发现蛋白酶体抑制剂可以使得iNOS无法降解而聚集。但是两者之间的相关性尚不明了，为此，我们进一步在PD动物模型上进行了蛋白酶体抑制剂与iNOS之间的关联性研究。        　　本实验通过蛋白酶体抑制剂Lactacystin制作大鼠PD模型，观察到在注射蛋白酶体抑制剂后1 d，大鼠黑质部位iNOS阳性细胞就达到高峰，1周后阳性细胞数已经明显下降，而黑质部位的TH阳性神经元在3周时才有明显下降，这说明iNOS促使了多巴胺神经元的丢失。本实验结果也提示UPS是PD发病的重要原因，而iNOS表达上调是其重要的中间过程。因此，阻断两者的发生均可能延缓甚至阻止多巴胺能神经元的变性；同时，针对性维持UPS功能或抑制iNOS活性均可能成为临床治疗PD的新靶点。

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