伏核脑深部刺激对吗啡成瘾心理依赖大鼠的作用研究

    作者：王丽丽    作者单位：上海交通大学医学院附属仁济医院神经外科， 上海 200127     【摘要】  目的 研究伏核脑深部刺激 （DBS） 对吗啡成瘾大鼠心理依赖的作用。 方法 将60只SD大鼠随机等分为三组：假刺激 （ShS） 组﹑DBS组﹑正常对照 （NS） 组。刺激前后行条件性位置偏爱实验，并观察伏核、海马、前额叶脑组织的形态学变化。 结果 刺激前DBS组与ShS组大鼠在伴药箱平均停留时间均长于NS组，差异显著 （P ＜0.01）；刺激后，DBS组较ShS组在伴药箱平均停留时间明显缩短 （P ＜0.01），而与NS组差异无统计学意义 （P ＞0.05）。刺激前，DBS组与ShS组大鼠伏核、海马神经元部分丢失，且水肿明显，细胞器减少；刺激后，DBS组较ShS组细胞水肿明显减轻，以伏核变化明显。 结论 伏核DBS有效治疗了大鼠的吗啡成瘾心理依赖作用。

    【关键词】  脑深部刺激 伏核 吗啡依赖 条件性位置偏爱

    Effect of deep brain stimulation of nucleus accumbens on psychological morphine dependence in rats

    WANG Lili1, WANG Guisong1, ZHAO Yongbo2, et al.

    1. Department of Neurosurgery, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200127, China;

    2. Department of Neurology, Shanghai First People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China

    Abstract：  Objective  To explore the effect of deep brain stimulation (DBS) of the nucleus accumbens on psychological morphine dependence in rats.  Methods  Sixty rats were randomly and equally divided into three groups: sham stimulation (ShS) group, DBS group and normal saline control (NS) group. Conditioned place preference test was carried out through the experiment, and the changes in brain tissue morphology of the nucleus accumbens, hippocampus and prefrontal lobe were observed.  Results  Before stimulation, the average stay time in the white case of DBS group and ShS group was longer than that of NS group (P < 0.01), while after stimulation, the average stay time of DBS group was shorter than that of ShS group (P < 0.01), but not significantly different from NS group (P > 0.05). Partial loss, obvious edema, and organelles reduction of the nucleus accumbens and hippocampus neurons were found in many rats of the DBS and ShS before DBS, and the changes were improved after DBS, especially in neurons of the nucleus accumbens.  Conclusion  The rats' psychological morphine dependence can be effectively treated by DBS.

    Key words:  deep brain stimulation;  nucleus accumbens;  morphine dependence;  conditioned place preference

    脑深部刺激 （deep brain stimulation，DBS） 是治疗功能性神经系统疾病的一种重要手段。药物成瘾是一种慢性反复发作性脑病，对心理依赖的治疗是目前研究的重点，也是难点。本研究将DBS电极植入吗啡心理依赖大鼠双侧伏核 （nucleus accumbens，NAc），观察刺激前后大鼠的行为学变化以及NAc、海马部位组织形态学的改变，探讨伏核DBS对大鼠吗啡心理依赖的作用。

    1    对象与方法

    1.1    实验动物    60只SD大鼠，雄性，实验之初体质量250～260 g，平均255 g，由上海斯莱克实验动物中心提供 （清洁级）。分笼饲养，自由摄食饮水，自然昼夜循环，非直接光照，通风良好，湿度50%～75%，温度 （25 ± 2） ℃；实验开始前，动物先在动物房内适应1周，每天抓持大鼠1次，使大鼠适应以后实验操作带来的刺激。实验均在8 ∶ 00～18 ∶ 00进行。随机等分为三组：假刺激 （ShS） 组﹑DBS组﹑正常对照 （NS） 组。遵循动物保护和使用规则。

    1.2    药物与仪器    盐酸吗啡注射液 （沈阳第一制药厂生产，批号061206），青霉素钠 （华北制药股份有限公司生产，批号：Y0511101），戊巴比妥钠 （中国医药上海化学试剂公司，批号：F20020915）。日本光电公司SEN-3201刺激器，SS-102J隔离器，美国ASI小动物立体定位仪，PowerLab记录系统，不锈钢刺激微电极，CPP实验大鼠活动箱，Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统，PHILIP CM-120透射电镜。

    1.3    大鼠吗啡成瘾心理依赖模型的建立    参照文献[1-2]，ShS与DBS组大鼠按逐日递增原则腹腔注射盐酸吗啡，连续14 d给药，起始剂量为5 mg／kg，每次注射前称重，3次/d （8 ∶ 00，12 ∶ 00，16 ∶ 00），每日递增5～10 mg／kg，2周时达到100 mg／kg。NS组给予相同体积生理盐水腹腔注射。第16 天，予1%戊巴比妥钠40 mg／kg腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于ASI小动物立体定位仪，根据Paxinos & Watson （1997） 图谱[3]，伏核坐标为：前囟前1.6 mm，中线旁开1.8 mm，硬膜下7.2 mm。沿中线作2.5 cm切口，逐层剥离皮下及肌肉组织，暴露前后囟。以骨钻在双侧钻2 mm的骨孔，并在骨孔周围1 cm左右拧入3枚螺丝；用小号针头刺破硬脑膜，根据大鼠伏核坐标，从骨孔向下推进自制不锈钢电极，涂牙科水泥固定。术后休息7 d，并注射青霉素钠预防感染。术后第8天设置刺激参数：频率130 Hz，波宽100 μs，强度3 V；连续7 d，每天连续刺激1 h。

    1.4    条件性位置偏爱 (CPP） 实验    采用上海吉量软件科技有限公司开发的吉量软件进行图像分析，记录大鼠在黑白箱的停留时间、活动距离及两箱之间的穿梭次数、运动轨迹等，周期为15 d。①训练前阶段：实验第1天，抽离中间隔板，每只动物放于中间通道处，自由活动15 min。本实验中大鼠普遍偏爱黑箱，故选择白箱为伴药箱。②条件化训练阶段：第2～14天放置中间隔板，隔离黑箱和白箱。每次训练45 min，均在8 ∶ 00～18 ∶ 00之间完成。腹腔注射吗啡后即刻放入白箱，时间相差5 min左右。对照组注射等体积生理盐水后即刻交替放于黑白两箱。③测试阶段：第15天和刺激结束后第2天、4天、6天，抽离中间隔板，每只动物放于中间通道处，自由活动15 min。  

    1.5    大鼠伏核、海马脑组织形态学变化    刺激结束后第7天，大鼠经4%多聚甲醛PBS液体灌注，依据鼠脑立体定位图谱，取三组大鼠伏核、海马组织，行苏木精-伊红染色，Axioplan 2 imaging 显微图像分析系统观察。另外，大鼠经2%戊二醛PBS固定液灌注后，取三组大鼠伏核、海马部位约1 mm3组织块，行PHILIP CM-120透射电镜观察。

    1.6    统计学分析    采用SAS统计软件包进行计量资料数据分析。吗啡戒断症状评分、条件性位置偏爱实验数据均用x ± s表示。多组均数间比较采用ANOVA单因素方差分析，组间比较用t检验。

    2    结    果 （图1~4） 

    2.1    位置偏爱实验结果 （表1）    ①刺激前ShS组和DBS组在黑箱停留的平均时间明显短于NS组，P ＜0.01。表明刺激前吗啡依赖大鼠对白箱有明显的偏好，心理依赖模型建立成功。②刺激后DBS组大鼠在黑箱中停留的平均时间较ShS组明显增长，P ＜0.01；较NS组差别不大，P ＞0.05。表明伏核DBS有效治疗了大鼠的吗啡心理依赖作用。

    2.2    大鼠伏核、海马苏木精-伊红染色观察 （图1，2）    ShS组大鼠伏核、海马可见神经元减少，神经元核固缩、碎裂甚至变性坏死等。DBS组大鼠伏核、海马神经元虽有少量胞体水肿，神经元核固缩、碎裂，但较ShS组明显改善；与NS组相比，有少量变性坏死、核固缩等变化。以上改变以伏核明显。

    2.3    大鼠伏核、海马电镜观察 （图3，4）    ShS组大鼠伏核、海马神经元水肿数量较NS组明显增多，细胞体积增大，排列紊乱，细胞内胞质贫乏，核糖体、线粒体和内质网数量减少，线粒体肿胀，空泡样变性，内质网、核糖体及高尔基复合体均肿胀，粗面内质网扩张；细胞核边界不规整；海马神经元改变类似伏核，但程度较轻。DBS组大鼠伏核、海马神经元水肿数量较ShS组有所减少，水肿减轻，细胞器变性减轻；与NS组不同的是，伏核、海马均有变性坏死的神经元及水肿神经元等存在。   

    3    讨    论

    中脑边缘多巴胺系统是阿片类引起心理依赖最主要的神经解剖学基础，且是阿片强化效应的最后通路，其纤维投射到NAc、前额叶、杏仁核、海马、黑质等脑区；NAc作为此系统的一部分，对所有药物的成瘾性具有关键性作用[4-7]。已有文献报告：损毁NAc能抑制大鼠对多种成瘾性药物的觅药行为[8-10]，但损毁的同时也会产生相应的副作用[11]。

    DBS是在脑的特定部位埋置微电极，脑外经刺激器控制，通过调整刺激的电压、脉宽、频率等参数，来治疗功能性神经系统疾病，如强迫症、癫（疒间）及药物成瘾的心理依赖戒断治疗等[12]。与损毁手术比较，DBS具有以下独特的优越性：①非破坏性和可逆性，利于将来采用更好的治疗方法。②可调节性：可通过调节刺激参数来缓解与刺激有关的不良反应，同时减少并发症和副作用的发生。③安全性高和疗效长期，可同时实施双侧DBS刺激，效果肯定。④几无永久性并发症[13]。DBS损伤范围小，其所造成的永久并发症的发生率极低。因此，近年来DBS逐渐替代了损毁手术，越来越受到国内外功能神经外科的关注。

    本实验发现：刺激后DBS组大鼠在伴药箱内停留时间明显短于ShS组，差异显著；表明伏核高频DBS对吗啡的心理依赖起到了有效的治疗作用，同时也证实了伏核在吗啡成瘾机制中的关键作用。

    海马是边缘环路的主要部分，参与情感、学习、记忆等高级神经活动，与成瘾记忆的形成有关[14]。神经解剖学研究结果显示：海马在药物心理依赖上具有重要作用[15]。本研究结果显示：刺激后DBS组大鼠伏核、海马神经元较ShS组水肿明显减轻，但以伏核改变为甚；表明伏核DBS可使海马神经元发生改变，同时也间接表明DBS不是毁损性手术，而是一种副作用较少的可逆性治疗手段。

    DBS是一种技术要求很高、很精细的手术，动物实验中较常见的并发症和副作用包括：①与手术相关：较为严重的是脑内穿刺时发生颅内出血引起死亡，以及动物出现烦躁、术后癫（疒间）等。②刺激相关：刺激电流向周围组织扩布或电极位置不准确而引起动物肌肉收缩，甚至在刺激过程中苏醒。③DBS装置有关：包括电极折断、电极移位、刺激器不能发放刺激脉冲以及装置植入路径感染等。本实验遇到的问题主要是刺激电极折断、电极移位和动物死亡。克服的方法包括：实验动物麻醉要达到实验所需状态，手术中动作轻柔，严格按照动物图谱进行手术，术中所钻骨孔应尽量小 （以防脑脊液流失），注意牙科水泥的封闭范围，术后环境保持安静、清洁，严格在无菌条件下手术，及术后应用抗生素等。

    本研究具有以下意义：①阐明了DBS治疗吗啡成瘾心理依赖的作用机制。②此实验的成功经验可应用于其他DBS模型的建立。③研发更完善的DBS刺激系统，包括适用于动物的可充电电池，刺激系统的“一体化”以及刺激微电极的“个体化”等。④探寻更多的刺激靶点，调整适当的刺激参数，建立合理的术后程控体系，以更方便和有效地研究DBS机制。⑤为研究动物模型刺激工具类型选择、参数设置等提供了参考价值。 

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