NF2基因对细胞增殖和细胞周期的影响

作者：贺华，彭彪，卞留贯，孙青芳，沈建康，林亦海，贺子建    作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院神经外科， 上海 200025； 广州市第一人民医院神经外科，广东广州 510180； 台州市中心医院神经外科， 浙江 台州 318000；上海瑞金医院集团闵行中心医院神经外科，上海 201100 　　【摘要】  目的 观察Ⅱ型神经纤维瘤 （neurofibromatosisⅡ，NF2） 基因对细胞增殖和细胞周期的影响。 方法 采用脂质体介导法将携带野生型NF2的真核表达载体导入大鼠神经鞘瘤RT4细胞，质粒转染成功后实验细胞分为pEGFP-N1组、pEGFP-NF2组和对照组 （未转染质粒组），以Western blot 分析目的基因的表达，并采用MTT 法和流式细胞仪检测细胞增殖和细胞周期。 结果 pEGFP-NF2组细胞merlin 蛋白出现明显高表达。pEGFP-NF2组细胞生长的抑制率高达37.7%，与对照组相比较，差异具有统计学意义 （P ＜0.05）；而pEGFP-N1组细胞生长的抑制率与对照组比较，差异无统计学意义 （P ＞0.05）。流式细胞仪检测显示NF2可以阻断细胞周期，使其处于G1-G0期。 结论 野生型NF2可抑制大鼠神经鞘瘤RT4细胞的增殖，阻断细胞周期，使其处于G1-G0期。

　　【关键词】  神经纤维瘤病2型； 基因，肿瘤抑制； 细胞周期

　　Effect of the transfected NF2 gene on cell cycle and proliferation of rat schwannoma cell line

　　HE Hua, PENG Biao, BIAN Liuguan, et al.

　　1. Department of Neurosurgery, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200025, China;

　　2. Department of Neurosurgery, Guangzhou First Municipal People's Hospital, Guangzhou 510180, China

　　Abstract:  Objective  To investigate the effect of the neurofibromatosisⅡ (NF2) gene on cell cycle and proliferation in rat schwannoma cell line.  Methods  The eukaryotic expression vector pEGFP-NF2 containing NF2 cDNA was transfected into RT4 cells of the rats by lipofectamine and then these cells were divided into pEGFP-N1 group, pEGFP-NF2 group and the control group (cells without transfection). The NF2 expression in the transfected RT4 cells was detected by Western-blotting. The cycle, proliferation and apoptosis of the RT4 cells were determined by the MTT and flow cytometry.  Results  High expression of merlin protein was found in the transfected RT4 cells of the pEGFP-NF2 group. The proliferation of pEGFP-NF2 cells were inhibited by 37.7% (P < 0.05 vs. the control group), while pEGFP-N1 cells showed no significant change in proliferation (P > 0.05 vs. the control group). The cell cycle from G1 to G0 of pEGFP-NF2 cells was inhibited.  Conclusion  Wide type NF2 gene might suppress the growth and induces apoptosis of rat schwannoma cell line RT4 cells.

　　Key words:  neurofibromatosis 2;  genes, tumor suppressor;  cell cycle

　　抑癌基因NF2的突变与缺失可见听神经瘤、脑膜瘤等病人[1]，其主要转录产物Merlin （或称Schwannomin） 蛋白通过与众多蛋白质直接或间接的相互作用，参与众多的细胞活动，从而具有调控细胞运动性，抑制细胞增殖等生物学功能。但schwannomin 抑制肿瘤发生的途径仍未确立，本研究通过构建pEGFP-NF2真核表达质粒。将NF2转染至大鼠神经鞘瘤RT4细胞，了解其对RT4细胞生长的影响，探讨其在大鼠神经鞘瘤RT4细胞生长抑制过程中的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1 材料与细胞株  

　　RT4-D6P2T细胞 （美国ATCC公司，ATCCnumberCRL2768）。pEGFP-NF2由上海交大医学院神经病学研究所构建，pEGFP-N1真核表达载体 （美国Invitrogen 公司）。DMEM培养基、胎牛血FCS、限制性内切酶、T4DNA 连接酶 （TakaRa 公司），低熔点琼脂糖 （华美公司），Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒 （美国Invitrogen 公司），质粒抽提试剂盒 （Qiagen 公司），胰蛋白酶 （美国Gibco 公司），DNA Ladder、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等 （美国Sigma公司），ECL 发光试剂盒 （Santa Cruz 生物技术公司），DNA胶回收试剂盒及PCR 产物回收试剂盒 （Promega 公司）。引物由上海英俊公司合成。

　　1.2 实验分组  

　　将生长状态良好的HepG2细胞分成3组：对照组 （RT4细胞）、空载体组 （pEGFP-N1转染RT4细胞）、实验组 （pEGFP-NF2转染RT4细胞）。

　　1.3 NF2质粒转染  

　　按照Lipofectamine 2000操作说明书，将编码人野生型NF2的真核表达质粒pEGFP-NF2和pEGFP-N1空载体分别转染对数生长期的RT4细胞。

　　1.4 Western-blot分析蛋白的表达情况  

　　采用0.25%胰蛋白酶消化，收集培养pEGFP-NF2细胞、pEGFP-N1 细胞，每个样本收集等量细胞，加入细胞裂解液，提取蛋白，以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白电泳转移到硝酸纤维膜上，膜上加入10% 脱脂奶粉封闭后，加入一抗工作液 （兔抗merlin多克隆抗体），4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL进行显像后拍照，图像经扫描仪扫描后，采用软件进行光密度积分值分析，每个图像重复3次，取平均值。

　　1.5NF2表达质粒对细胞增殖的影响   　

　　取pEGFP-NF2细胞、pEGFP-N1细胞分别在DMEM培养基培养48 h后，加入10 mg/mL MTT 10 μL，继续培养4 h，在加入二甲基亚砜 （DMSO）后取出，用酶标仪测定吸光度A570 nm，结果取3 个平行孔的均值，重复3次，计算RT4细胞的存活率、细胞抑制率。

　　1.6 细胞周期检测  

　　用0.25%胰蛋白酶消化细胞，离心收集各转染组细胞，PBS 洗3 次，重复离心步骤，加入70%酒精固定24 h，检测前1 h 离心，用RNaseA  （20 μg/ml） 37 ℃处理30 min，PBS洗3 次，加入200 μL预冷Solution C （PI 染色液50 μg/ml），染色30 min， 避光，流式细胞仪检测各细胞周期比例，以未转染任何质粒的细胞作为空白对照、以转染pEGFP-N1空质粒的细胞作为阴性对照。将GFP-NF2转染进RT4，测定GFP阳性细胞的细胞周期情况，用ModFIT软件分析其细胞周期。

　　1.7 nocodazole对RT4细胞的影响　 

　　参照Sigma公司的产品说明书，用DMSO配制5 mg/L的Nocodazole储存液。使用前用DMEM完全培养液稀释成50 nmol/L，作用于各组细胞24 h后，分析细胞周期，方法同前。

　　1.8 BrdU细胞标记实验　 

　　加入BrdU 前接种细胞于盖玻片上，37 ℃、5% CO2培养箱中培养并加入终浓度为10 μmol/L BrdU，继续培养4 h，加入固定液 （甲醇 ∶ 冰醋酸 = 3 ∶ 1） 于-20 ℃固定20 min，PBS冲洗后加入2 mol/L HCl，37 ℃作用40 min，用硼酸盐溶液中和，接着用含1% TritonX-100的PBS洗涤3次，3% BSA 封闭1 h，加入BrdU 单克隆抗体，4 ℃过夜，接着加入FITC 标记的羊抗鼠IgG，于37 ℃条件下闭光反应1 h，最后滴加浓度为50 mg/ml的PI溶液37 ℃作用30 min，倒置荧光显微镜下计数。随机选取5~7个视野分别计算BrdU标记的阳性细胞数和PI 标记的细胞总数 （不少于800个细胞），标记指数 = BrdU标记的细胞数/PI 标记的细胞数。每组实验重复3 次。

　　1.9 统计分析　 

　　计量资料用x ± s表示，使用SPSS 15.0统计软件进行统计分析。行单因素方差分析和q检验，两组抑制率比较行t检验。

　　2结果

　　2.1NF2 基因转染情况    　　采用脂质体介导法，将质粒pEGFP-NF2和pEGFP-N1转染入RT4中，经嘌呤霉素持续筛选，获得阳性转染的细胞克隆。

　　2.2NF2蛋白的表达水平 （图1） 

　　pEGFP-NF2细胞具有明显的NF2蛋白条带，而RT4细胞的NF2蛋白条带不明显，说明：RT4细胞的NF2蛋白表达水平非常低，而转染后NF2蛋白水平出现高表达。  

　　2.3 NF2质粒对肿瘤细胞增殖的影响 （表1）    　　pEGFP-NF2组与pEGFP-N1组比较，细胞增殖明显受到抑制，抑制率为37.7% （P ＜0.05）；而pEGFP-N1组细胞增殖与对照组比较，差异无统计学意义 （P ＞0.05）。

　　2.4  外源性pEGFP-NF2对细胞周期的影响

　　2.4.1 流式细胞仪检测结果：  

　　pEGFP-NF2组与对照组比较，G1 期细胞数由55.47%增加到64.16%，S期细胞数由37.66%变为32.20%，提示从G1期到S期发生抑制。而pEGFP-N1组与对照组比较，差异无统计学意义 （P ＞0.05）。

　　2.4.2 nocodazole对细胞周期的影响（图2）：  

　　在RT4细胞中，NF2过表达能使G1期的细胞从77%增加到89%。nocodazole处理后，对照组细胞均进入G2-M期，而处理前仅少量的细胞进入G2-M期。

　　2.4.3  BrdU标记实验 （图3）：  

　　对照组细胞在BrdU中培养16 h后，87%的细胞BrdU阳性；而在NF2过表达的细胞中，仅25%的细胞为BrdU阳性。

　　3 讨论        　　随着分子生物学和细胞生物学技术的广泛应用，现有研究证实Ⅱ型神经纤维瘤 （NF2） 的发生主要与NF2基因缺陷有关。国内外学者对NF2的发病机制进行了深入研究。本组前期研究表明：NF2基因通过突变失活，导致了其编码的蛋白质变性，从而丧失了对肿瘤的抑制作用[2-5]。但NF2基因的抑瘤作用途径仍不明了。         　　我们认识到，肿瘤发生的主要原因是细胞周期失调后导致细胞无限制地增殖。从分子水平看，由于基因突变致使细胞周期的促进因子 （或称“癌蛋白”） 不恰当地活化，或抑制因子 （即“抑癌蛋白”） 失活，造成细胞周期调节失控。其中，破坏调节点的正常控制使细胞同期调控系统持续得到“增殖”的指令，是肿瘤细胞固有的特点。在肿瘤形成过程中，通过研究NF2对细胞周期的影响，我们可以追寻到NF2影响了哪些细胞分裂周期调节蛋白，从而起到了抑瘤作用。        　　本研究以大鼠神经鞘瘤为实验材料，研究了NF2对细胞增殖周期的影响。本实验所采用的野生型NF2表达质粒pEGFP-NF2是通过将全长为1 770 bp 的人NF2基因cDNA 连接到pEGFP-N1载体上构建而成；Western blot 检测结果表明：转染pEGFP-NF2质粒细胞NF2产物蛋白高表达，而对照组几乎无表达，说明NF2质粒转染到RT4细胞后能提高NF2蛋白的表达水平。        　　本组研究重点观察了NF2基因对RT4的影响。在细胞增殖方面，本组MTT研究结果显示：pEGFP-NF2组与pEGFP-N1组、对照组比较，差异均有统计学意义；而 pEGFP-N1组与对照组比较，差异无统计学意义，排除了空载体对细胞的毒副作用。本组数据同时说明：转染pEGFP-NF2质粒能够在一定程度上抑制RT4细胞的生长。流式细胞仪的检测结果显示：转染pEGFP-NF2质粒可以诱导细胞停滞在G0-G1期，处于M期的细胞会明显较少。这表明NF2质粒转染到RT4细胞后，在一定程度上抑制了RT4细胞的生长，可以将瘤细胞阻滞于静止期，合成期缩短，从而发挥其抑瘤作用。        　　本实验研究结果显示：野生型NF2基因转染具有抑制肿瘤细胞生长，引起细胞周期发生阻滞的作用。其作用机制可能与Rac信号转导途径有关。 Rac在细胞分裂周期的G1相中是必不可少的，因为它能激发细胞周期蛋白D1的转录[6]。这对于在G1相中细胞通过细胞周期关卡，进入S相是至关重要的。Rac还能激活一系列胞内信号转导途径，这些转导途径涉及细胞增生、转换和转录激活。下游区的信号转导受Rac的调节，包括JNK、p38和NF-κB途径[7]。在以后的研究中，我们将努力提高对呈网络状信号转导通路的认识，从而为寻找肿瘤细胞药物治疗的靶点提供理论基础。

【参考文献】　　[1] 卞留贯. NF2肿瘤抑制基因与中枢神经系统良性肿瘤 [J]. 国外医学·神经病学神经外科学分册, 1998, 25(3): 124- 127.

　　[2] 沈建康, 卞留贯, 孙青芳, 等. 神经鞘瘤的NF2基因突变分析 [J]. 中华神经外科杂志, 2002, 18(2): 96-99.

　　[3] 卞留贯, 孙青芳, 沈建康, 等. 神经鞘瘤的NF2基因2、4、6、13外显子突变分析 [J]. 中国神经精神疾病杂志, 2001, 27(6): 401-404.

　　[4] BIAN L G, TIRAKOTAI W, SUN QF, et al. Molecular genetics alterations and tumor behavior of sporadic ves- tibular schwannoma from the People's Republic of China [J]. J Neurooncol, 2005, 73(3):253-260.

　　[5] BIAN L G, SUN Q F, TIRAKOTAI W, et al. Loss of heterozygosity on chromosome 22 in sporadic schwannoma and its relation to the proliferation of tumor cells [J]. Chin Med J (Engl), 2005, 118(18): 1517-1524.

　　[6] SCHULZE K M, HANEMANN C O, MULLER H W, et al. Transduction of wild-type merlin into human schwannoma cells decreases schwannoma cell growth and induces apop- tosis [J]. Hum Mol Genet, 2002, 11(1): 69-76.

　　[7] SHAW R J, PAEZ J G, CURTO M, et al. The NF2 tumor suppressor, merlin, functions in Rac-dependent signaling [J]. Dev Cell, 2001, 1(1): 63-72.