蛋白激酶C活性在脑血管痉挛过程中的变化
发表时间：2009-06-30 浏览次数：662次
作者：周任,柏鲁宁,吕健,崔刚
作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院神经外科，陕西西安 710004
【摘要】 目的 探讨蛋白激酶C(PKC)活性在脑血管痉挛(CVS)过程中的变化及其意义。方法 日本大耳白兔25只，随机分为对照组(5只)与模型组(CVS组，20只)，CVS组又分为1、3、5、8d组，每组5只。采用枕大池2次注血法建立脑血管痉挛动物模型，血管造影观察基底动脉(BA)痉挛，放射免疫法和放射性同位素标记蛋白激酶测定法动态测定血浆内皮素和兔BA管壁PKC活性。结果 枕大池2次注血法可以成功构建脑血管痉挛模型，是一种简便、可靠的方法；模型组血浆中内皮素含量和BA壁内PKC的活性均明显升高，且在5d组达到峰值，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PKC活性与CVS的严重程度呈正相关。
【关键词】 脑血管痉挛；蛋白激酶C；内皮素
PKC activity change in the process of cerebral vasospasm
Zhou Ren, Bai Luning, Lü Jian, Cui Gang, Gong Shouping, Shi Wei
(Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China)
ABSTRACT: Objective To investigate the change of protein kinase C in the process of cerebral vasospasm (CVS) and evaluate its significance. Methods The subjects were divided into control group (n=5) and CVS group (n=20). CVS group was divided into day 1, day 3, day 5, and day 8 subgroups. Twicehemorrhage method was used to establish the rabbit model, angiography was performed to observe the cerebral vasospasm of the basilar artery, and ET level and PKC activity were measured with radioimmunoassay and radioisotopic protein kinase assay kit. Results The twicehemorrhage rabbit model was a simple and reliable one. ET level in the blood plasma and PKC activity of the basilar artery vessel wall was increased in the CVS group, and reached peak in the day 5 group. The difference was significant (P<0.05) compared with that in the control group. Conclusion There is a positive correlation between PKC activity and CVS severity.
KEY WORDS: cerebral vasospasm (CVS); protein kinase C (PKC); endothelin (ET)
脑血管痉挛(cerebral vasospasm, CVS)是影响蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)预后的重要因素[12],其病理生理机制目前尚不十分清楚。近年来研究表明，细胞信号传递系统中的重要信号分子蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)可能在SAH后CVS发生发展中起重要作用[3]。PKC是一类Ca2+ 磷脂依赖性蛋白激酶，通过催化多种蛋白质上的Ser/Thr磷酸化，调节细胞的代谢、生长、增殖和分化。在本研究中，我们采用兔枕大池2次注血法成功建立CVS模型,动态观察CVS病理过程中血浆中内皮素(endothelin, ET)和基底动脉(basilar artery, BA)内PKC活性的变化,探讨PKC与CVS的关系,为进一步揭示CVS的病理机制提供新的线索。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 [γ32P]ATP(3000ci/mmol)购自Amersham公司；PKC检测盒购自Promega 公司； 蛋白质定量试剂购自Pierce公司；Triton X100购自Sigma公司；DE52购自Whatman公司；ET放免药盒购自中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所；Cordis 3F MASSTRANSIT微导管盒购自美国强生公司。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立 日本大耳白兔25只，体重2.3-3.0kg，平均2.8kg，雌雄不限，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。动物模型采用枕大池2次注血法建立，第1次行枕大池穿刺并缓慢注入未肝素化自体动脉血2.5mL，48h后，再次注血2.0mL。
1.2.2 实验分组 将所有实验动物分为2组：对照组5只；模型组(CVS组)20只，又分为1、3、5、8d组，每小组5只。分别在第2次注血后第1天、第3天、第5天及第8天行椎动脉造影，然后经耳中央动脉抽血2mL后处死取脑。
1.2.3 基底动脉造影 运用美国强生Cordis 3F MASSTRANSIT微导管盒和飞利浦数字减影机进行兔选择性脑血管造影。分离兔的股动脉，直视下穿刺，X线指引下，将导管和导丝送入到锁骨下动脉的开口，快速注射造影剂，基底动脉能较好的显影；而颈内动脉系统不显影。
1.2.4 ET含量检测 经兔耳中央动脉取血2mL，置于预先加入100g/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)30μL和抑肽酶40μL的试管内，混匀，在4℃，3000r/min离心10min，分离上清液，放于-20℃的冰箱内保存。测定前，使样品置于室温或冷水中复融，再次4℃，3000r/min离心5min，取上清液测定。分离上清液按照内皮素试剂盒说明进行测量。
1.2.5 PKC活性检测 经耳缘静脉快速推注空气50mL处死兔,迅速开颅取含有基底动脉全长的脑干及部分小脑组织，立即浸入盛有冰浴的PBS烧杯中。眼科剪仔细剪除表面蛛网膜及血管分支,显微注射器轻柔冲洗血管腔内血块，操作中忌对血管牵拉过重，然后将标本放入液氮中冻存待测。以上操作均在冰浴的PBS液中进行。然后按PKC试剂盒测量其活性。蛋白定量采用BCA法。
1.3 统计学处理 实验结果以(±s)表示，两组间的显著性差异比较采用方差分析；PKC与BA之间及ET与BA之间采用相关性检验，r为两者之间的相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血管造影 CVS组动物尸解发现基底动脉周围和枕大池内均有血凝块，脑血管造影可见基底动脉管径粗细不均，造影剂显影不均匀，脑桥支和终末支(大脑后动脉)闭塞，5d组痉挛程度最严重；而对照组基底动脉管径粗细均匀，造影剂显影均匀，脑桥支和终末支正常显影(图1)。
2.2 ET、PKC和BA在CVS过程中的变化 在CVS组中，血浆ET水平和BA管壁PKC活性明显升高，5d组达到高峰，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；8d组开始下降。而BA管径在CVS组中痉挛变细，5d组痉挛最为严重，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；8d组痉挛开始缓解。ET与BA之间在α=0.05水平上显著相关(r=-0.954)，PKC与BA之间在α=0.05水平上也显著相关(r=-0.914，表1)。
图1 不同时期兔脑血管造影图（略）
Fig.1 The brain angiography of rabbits at the different times
表1 CVS过程中血浆ET和基底动脉壁PKC活性的变化（略）
Table 1 ET level and PKC activity in the process of CVS
*P<0.05 vs. control group
3 讨论 在本研究中，CVS组动物尸解发现基底动脉周围和枕大池内均有血凝块，造影发现BA痉挛变细，提示枕大池2次注血法可以成功构建脑血管痉挛模型。CVS组血浆ET含量以及BA管壁PKC活性均明显增高，与对照组比较有显著性差异(P<0.05)，提示PKC活性与CVS的发生显著相关，且与CVS程度的变化规律一致，其作用机制可能与内皮素有关。 自从Ecker等于1951年首次报道了经血管造影证实SAH后出现CVS现象以来，50多年来进行了大量的动物实验和临床研究。先前对SAH后诱发脑血管痉挛的因素如血小板释放产物(如5羟色胺、血管紧张素、儿茶酚胺、钾离子等)、红细胞分解产物(包括氧合血红蛋白和ATP管壁的作用、NO与ET之间的失平衡)以及离子通道障碍对平滑肌细胞的影响等进行了大量研究。其中ET1在脑血管痉挛发生、发展过程中的作用受到广泛重视，但研究结果仍有很大分歧，特别是ET1在脑血管痉挛发生过程中是作为始动因素还是伴随现象，血浆、脑脊液和基底动脉中ET1水平哪一个更具有临床意义，目前争论较大[2]。而且, ET1究竟是通过什么机制引起CVS,目前仍不清楚。
近年来，国外学者在研究中发现，脑血管平滑肌细胞收缩调节信号转导途径的激活在脑血管痉挛发生、发展过程中起着重要作用。平滑肌细胞收缩调节信号转导包括两个途径：肌球蛋白轻链激酶(MLCK)途径和PKC途径。MLCK途径的激活在急性脑血管痉挛中起着重要作用(已被大量研究所证实)，但随着病程的发展，其作用逐渐减弱，而PKC途径被持续不断的激活才是维持脑血管痉挛的关键因素。实验证明，PKC激活可引起CVS，而且在SAH后，PKC的表达增加,在收缩的血管，PKC效能的增加和SAH后血管痉孪的进展在时间上有一致性，PKC抑制剂可抑制CVS的发展[45]。本研究结果表明，血浆中ET水平和BA管壁内PKC活性升高均与SAH后CVS的发生有关。 Masayo等[6]在犬的2次注血模型中发现，激活的PKC持续升高至SAH后的第7天，在SAH后第14天，其水平降低，而且，具有活性的PKCδ和PKCα均未检测到；然而，在7-14d，CVS仍在继续。由此可见，SAH后的CVS是由多种信号转导途径调节，包括Rho激酶、PKC、受体型TPKRasMAPK等[78]。多种信号转导途径的参与使得其研究更为复杂。SAH后, ET与PKC之间有什么关系本实验尚未涉及,有待于下一步的研究。
【参考文献】 [1]Nishizawa S, Laher I. Signaling mechanisms in cerebral vasospasm [J]. TCM, 2005, 15(1):2427.
[2]Lin CL, Jeng AY, Howng SL, et al. Endothelin and subarachnoid hemorrhageinduced cerebral vasospasm: pathogenesis and treatment [J]. Curr Med Chem, 2004, 11:17791791.
[3]Laher I, Zhang JH. Protein kinase C and cerebral vasospasm [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2001, 21:887906.
[4]Nishizawa S, Yamamoto S, Yokoyama T, et al. Dysfunction of nitric oxidesynthase induces protein kinase C activation resulting in vasospasm after subarachnoid hemorrhage [J]. Neurol Res, 1997, 19:558562.
[5]Nishizawa S, Obara K, Koide M, et al. Attenuation of canine cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage by protein kinase C inhibitors despite augmented phosphorylation of myosin light chain [J]. J Vasc Res, 2003, 40:169178.
[6]Masayo K, Shigeru N, Seiji O, et al. Chronological changes of the contractile mechanism in prolonged vasospasm after subarachnoid hemorrhage: from protein kinase C to protein tyrosine kinase [J]. Neurosurgery, 2002, 51(6):14681476.
[7]Kusaka G, Kimura H, Kusaka I, et al. Contribution of Src tyrosine kinase to cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage [J]. J Neurosurg, 2003, 99:383390.
[8]周任，吕健，黄卫东，等. 创伤性脑血管痉挛与内皮素1水平变化的关系 [J]. 西安交通大学学报(医学版), 2002, 23(2):164166.
(编辑 卓选鹏)
基金项目：陕西省科技攻关基金资助项目(No.2002KG6)
