海人酸损伤后海马神经干细胞的异常分布及骨形成蛋白4的表达

作者：尹清    作者单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院康复理疗科， 重庆 400038 　　【摘要】  目的 探讨海人酸 （kainic acid，KA） 侧脑室注射致大鼠海马损伤后，大鼠海马的异位神经干细胞分布特点及骨形成蛋白4 （bone morphogenetic proteins-4，BMP4） 的表达。 方法 侧脑室注射KA 3 d~2周后，免疫组化检测海马神经元的丢失情况 （NeuN染色） 和海马齿状回Nestin阳性细胞的分布情况，原位杂交检测同期BMP4-mRNA阳性细胞的分布。 结果 KA注射后1周，注射侧海马CA3、CA4区神经元丢失明显且在整个实验观察阶段均存在。KA注射2周后，在海马齿回门区出现大量异常分布的Nestin阳性细胞，这些细胞成团分布，同期可观察到BMP4-mRNA阳性细胞在该部位有较多分布。KA注射4周后，海马齿回门区Nestin阳性细胞数量增多，突起延长且突起数量增多。 结论 KA侧脑室注射致大鼠海马损伤后，海马齿状回颗粒细胞异常增殖和迁移，主要分布在海马齿回门区，可能与BMP4在该区的过表达有关。

　　【关键词】  神经干细胞 红藻酸 海马 骨形成蛋白 大鼠

　　Distribution features of ectopic neural stem cells in the kainic acid injured hippocampus and expression of bone morphogenetic protein-4 in adult rats

　　YIN Qing, XU Haiwei, YIN Jinbo, et al.

　　Department of Rehabilitation, Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, China;  Department of Neurology;  Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037, China;  Department of Physiology, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

　　Abstract:  Objective  To explore the ectopic distribution of neural stem cells in the dentate gyrus (DG) of the kainic acid (KA) injured hippocampus of the rats and the expression of bone morphogenetic protein-4 (BMP4).  Methods  During the period from day 3 to 2 weeks after lateral ventricular injection of KA, immunohistochemical staining was used to test the loss of the NeuN-positive neurons and distribution of the nestin-positive cells in the DG of the hippocampus. In situ hybridization was used to detect the distribution of the BMP4-mRNA positive cells in the hippocampus at the same time.  Results  The number of NeuN-positive neurons in the ipsilateral CA3 and CA4 areas of the hippocampus was markedly decreased 1 week after KA injection and the cell loss were observed during the whole experimental process. The nestin-positive cells were observed mainly localized in the hilus of the DG 2 week after KA injection and BMP4 mRNA-positive cells distributed mainly in the hilus of the DG. Four week after KA injection, the number of nestin-positive cells was markedly increased and the length and number of the processes of these cells were significantly increased.  Conclusion  The ectopic distribution of Nestin-positive cells in the DG after KA injection may be related to the over-expression of BMP4 in the hippocampus.

　　Key words:  neural stem cell;  kainic acid;  hippocampus;  bone morphogenetic protein;  rats         　　颞叶癫疒闲发病过程中存在着海马神经发生异常，且癫疒闲发作所致的海马神经干细胞增殖与骨形成蛋白4 （bone morphogenetic protein-4，BMP4） 的过表达有关[1-4]。本实验运用海人酸 （kainic acid，KA） 损伤模型，采用组织化学和原位杂交技术观察海马齿回神经干细胞的迁移和分布，为探讨癫疒闲发病机制提供线索。

　　1    材料与方法

　　1.1    实验动物和试剂    健康雄性SD大鼠24只，体质量 （200 ± 10） g，由第三军医大学实验动物中心提供。大鼠分为空白对照组、人工脑脊液对照组及实验组，每组8只。实验组大鼠侧脑室注射KA。人工脑脊液对照组给予相应剂量的人工脑脊液，空白对照组不作处理，各组动物于术后7 d灌注取材。KA、鼠抗Nestin一抗 （1 ∶ 1 000）均购自Sigma公司，鼠抗NeuN一抗 （1 ∶ 400）、SABC免疫组化试剂盒、DAB试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2    KA致兴奋性毒性大鼠脑损伤模型    将KA 0.5 μg溶于1.0 μl生理盐水中，0.3%戊巴比妥钠麻醉大鼠成功后，经脑立体定位仪用微量注射器将KA注入大鼠右侧侧脑室，按立体定位图谱[5]，注射坐标为 （AP：+4.3；ML：+4.4；DV：-3.4）。人工脑脊液对照组大鼠为右侧侧脑室注射1.0 μl人工脑脊液。

　　1.3    大鼠脑组织固定和免疫组化    大鼠脑组织按常规灌流、固定、取脑组织进行冰冻切片 （30 μm）[6]。参考王伯云[6]等方法，脑片经0.01 M PBS漂洗后， 3%双氧水孵育15 min，封闭内源性过氧化物酶。切片在0.3% TritonX-100孵育30 min，正常山羊血清封闭液30 min，在含NeuN、Nestin抗体4 ℃孵育12 h。羊抗兔二抗孵育2~3 h，SABC三抗37 ℃孵育1~2 h。以上操作之间，均以0.01 M PBS漂洗，5 min × 3。DAB-反应。裱片后将切片自然干燥，梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片。

　　1.4    BMP4原位杂交    按照既往方法[7]脑切片在0.1 M PBS （pH 7.2） 及0.1 M 甘氨酸-PBS中漂洗后，加入 0.3% Triton X-100-PBS漂洗，然后用蛋白酶K （2 mg/L） 37 ℃孵育25 min，4%多聚甲醛漂洗后，浸入新配制的0.1 M Tris-HCl （pH 8.0，含0.25%乙酸酐） 中漂洗10 min，2 × SSC漂洗10 min。按10 μl/张切片，取杂交液 （含0.5 mg/ L地高辛标记的BMP4 cRNA 探针，武汉博士德） 于1.5 ml平底离心管中，将脑切片移入杂交管中，42 ℃反应12~24 h。切片依次移入4 × SSC、2 × SSC、1 × SSC及0.5 × SSC中各漂洗10 min （37 ℃），将切片移入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体 （Roche，按1 ∶ 1 000稀释于反应液中） 中孵育4 h （37 ℃）。TSM1、TSM2中各漂洗10 min × 2次，室温。NBT-BCIP （武汉博士德，400 μg/ml；200 μg/ml TSM2 配制） 室温避光反应3~5 h，0.02 M EDTA 终止反应后，多聚赖氨酸处理的玻片裱片、脱水、DPX封片。阳性细胞为深蓝色。以不含探针的杂交液代替含寡核苷酸探针的杂交液；以正常羊血清代替兔抗地高辛抗体。

　　1.5    细胞计数及统计学分析    取相邻部位5张切片分别行NeuN、Nestin免疫组化染色，BMP4原位杂交。每只大鼠每项检查取5张脑切片。光镜下观察并计数每张切片海马NeuN、Nestin阳性细胞，BMP4-mRNA阳性细胞的数量。所得数据采用均数 ± 标准差 （x ± s） 表示，采用SPSS 10.0统计学软件，进行t检验，以P ＜0.05为具有统计学意义。

　　2    结果 （图1~3）

　　2.1    KA注射后海马神经元的丢失    大鼠侧脑室注射KA 2周后，NeuN免疫组化染色显示，人工脑脊液对照组和空白对照组双侧海马无明显NeuN阳性细胞丢失 （图1A）。右侧脑室注射KA 1周后，注射侧海马CA3、CA4区NeuN阳性细胞数量较人工脑脊液对照组显著减少 （图1B，P ＜0.01），这种海马CA3、CA4区NeuN阳性细胞减少的状态在整个实验观察阶段均存在，无细胞数量恢复的迹象。KA注射对侧海马神经元丢失不明显。

　　2.2    KA损伤后海马神经干细胞的异常分布    侧脑室注射人工脑脊液后2周，注射侧 （图2A） 和对侧 （图2B） 海马齿回门区未发现Nestin阳性细胞。而在同期侧脑室注射KA的同侧，海马齿回门区出现成团的、胞体较小同时有细胞突起的Nestin阳性细胞 （图2C），在海马的其他区域几乎未见Nestin阳性细胞。在侧脑室注射KA 4周后，海马齿回门区的Nestin阳性细胞数量显著增多 （图2D）、同时阳性细胞胞体进一步减小，而细胞突起数量增多、突起长度显著增长，在海马的其他区域未见Nestin阳性细胞。侧脑室注射KA 4周后同侧海马齿回门区Nestin阳性细胞数较注射2周后显著增加 （表1， P ＜0.05）。人工脑脊液对照组和空白对照组双侧海马齿回门区未见Nestin阳性细胞。

　　2.3    BMP4表达与神经干细胞分布的关系    在侧脑室注射人工脑脊液2周后，注射侧海马齿回有少量BMP4-mRNA阳性细胞 （图3A），主要分布在海马齿回颗粒细胞层和颗粒下区。在同期侧脑室注射KA的同侧，海马齿回BMP4-mRNA阳性细胞数量显著增多 （图3B），同时在海马齿回门区出现大量BMP4-mRNA阳性细胞。注射KA的对侧海马齿回BMP4-mRNA阳性细胞数量也显著升高。人工脑脊液对照组和空白对照组BMP4双侧海马BMP4-mRNA阳性细胞主要局限在海马齿回颗粒细胞层和颗粒下区，海马齿回门区未见BMP4-mRNA阳性细胞。

　　3    讨论        　　KA结构类似谷氨酸，进入脑内后与海马齿状回颗粒细胞轴突末梢上的KA受体结合，增加突触末梢膜的通透性，使得颗粒细胞中的谷氨酸大量释放而重吸收减少，从而引起突触后神经元海马CA3 区锥体细胞过度兴奋，最后导致CA3、CA4区的锥体细胞减少、消失，以及齿状回神经细胞增殖、胶质增生等一系列病理改变，从而诱发颞叶癫疒闲，即KA癫疒闲模型[4]。KA诱发的边缘性惊厥和海马结构损伤与人类颞叶癫疒闲的惊厥行为及Ammon's角硬化有很多相似之处，是目前研究颞叶癫疒闲的良好动物模型。本实验发现，侧脑室注入KA后引起海马CA3、CA4区神经元丢失明显，海马齿状回、CA3等区胶质细胞明显增生，与人颞叶癫疒闲病理一致。        　　海马齿状回是目前公认的成年个体两个神经发生最集中的区域[1]。各种有害性刺激，如癫疒闲发作、外伤、缺氧，均可引起大鼠海马齿状回神经干细胞明显增殖及胶质细胞增生。同时齿状回分子层出现苔藓纤维发芽，表明神经元可塑性增加。BMP即骨形成蛋白 （bone morphogenic protein，BMP），属于转化生长因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 超家族成员。该家族成员包括TGF-β、抑制素、活化素、dpp和BMP等[6]。BMP4在生后及成年的中枢神经系统亦有表达，对不同脑区神经干细胞的增殖与分化有重要调控作用[8]。我们近期对室周多潜能的神经干细胞在胚胎、生后及成年期的增殖分化进行的研究表明，在整个发育过程中BMP4对神经干细胞具有诱导其增殖和分化的作用[9]。我们对成年室下区NSC的研究进一步证实：BMP4可调控成年室下区NSC的分化，其中BMP4通过促进向胶质细胞的分化而抑制神经发生[10]。因此我们推测在侧脑室注射KA诱导的神经发生中，BMP4可能也起了重要做用。目前对于BMP4在此过程中在海马齿状回的表达，以及在此区神经干细胞增殖、分化、迁移中的作用尚缺乏相应的研究资料。        　　本研究表明：侧脑室注射KA后3~7 d，海马神经增殖及胶质增生最明显，KA注射1周后，注射侧海马CA3、CA4区神经元丢失明显，这与文献报告一致。KA注射2周后，在海马齿回门区出现大量异常分布的Nestin阳性细胞，这些细胞成团分布，随着时间延长，注射后4周时Nestin阳性细胞数量增多，同时胞体缩小，突起增多且长度延长，提示在海马齿回门区存在异常的神经干细胞向神经元分化，即存在异位神经发生。        　　本实验还发现在KA注射后，BMP4表达明显上升，BMP4的表达变化与Nestin表达位置基本一致，表明BMP4可能在KA注射诱导的神经干细胞增殖、迁移、分化中扮演一定的角色。Scharfman等[11]报告迁移到海马齿回门区异位颗粒细胞的形态学特征、神经递质表型及静息电位、动作电位与正常的颗粒层颗粒细胞非常相似，但具有自发的爆发性放电，且此放电可以沿苔藓纤维传导至CA3区锥体细胞，并与CA3区锥体细胞形成同步放电，而原有颗粒细胞不具有这些特征[11]，提示异位神经发生是KA导致颞叶癫疒闲发生的重要机理之一。在海马齿回增强的神经干细胞未能正确迁移到发生显著神经元丢失的CA3，CA4区的原因，可能是BMP4-mRNA在海马齿回门区的过表达，引导神经干细胞停留在此区进行神经发生。

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