ING4基因抗肿瘤作用的研究进展

作者：陈 斌 综述 邓跃飞 审校    作者单位：中山大学第二医院神经外科， 广东 广州 510120     【摘要】  ING4 （inhibitor of growth family member 4） 基因是近年发现的肿瘤抑制基因，广泛参与肿瘤发生、发展的多个过程，包括肿瘤血管的生成，细胞对缺氧状态的适应，细胞间接触抑制的丢失，及抑制肿瘤细胞侵袭转移、细胞凋亡与生长周期调节等。本文就近年来有关对ING4基因抗肿瘤作用的研究进展进行综述。

    【关键词】  基因，ING4； 基因，肿瘤抑制； 细胞凋亡； 综述文献

    1.1    概述    ING4 属于肿瘤生长抑制因子家族，于2000年首次从人垂体组织中提取获得，该家族被认为是p53基因活动所必需的一个蛋白家族。目前研究认为：ING4 定位于12p13-32，由8个外显子和7个内含子组成，范围覆盖约13 000个碱基对 （图1）。人与小鼠的ING4 基因 （含终止密码子tag） 长度均为747 bp，编码蛋白的组成99%以上相同。基因文库中提供了两种不同的ING4 mRNA转录物：NM016162含1 717 碱基对，编码 248个氨基酸； BC007781含1 377 碱基对，编码249个氨基酸。这两种转录子的不同源于1个碱基序列的移除，其造成编码蛋白的改变，前者131位氨基酸为丝氨酸，后者131-132位氨基酸为赖氨酸-甘氨酸。两种转录物均不会造成ING4 读码框的改变。这种情况的出现是基因表达的多态性还是剪接变体，或是一种病理现象，仍需进一步研究[1]。

    1.2    编码蛋白    ING4 基因产生的核不均RNA （hnRNA） 通过对某些剪切位点的选择，可产生四种不同的剪接变体，即ING4-V1、ING4-V2、ING4-V3和ING4-V4。其中V1是ING4 最长的剪接变体，也是最早分离到的ING4 蛋白[1]。它同ING家族蛋白的其他成员一样，具有核定位信号 （nuclear localization signal，NLS） 以及C末端高度保守的PHD （plant homeodomain） 锌指结构域[2]。PHD是具Cys4-His-Cys3特征结构的锌指结构域，其广泛存在于植物或动物的转录调节蛋白中。ING4-V1的NLS位于氨基酸序列中段，包括127~167位氨基酸，具有多个含正电荷的赖氨酸，对于ING4-V1在核内的定位及其与p53基因的相互作用有着重要的意义。目前普遍认为：V1通过对染色体的改构发挥调节作用。而最近的研究也证实，ING4-V1能够乙酰化组蛋白H4的多个赖氨酸残基，且能通过PHD与甲基化的组蛋白H3相互作用，从而改变染色体的空间结构，发挥作用[3-4]。而ING4-V2、V3、V4由于hnRNA剪切部位的不同，只具有部分或无核定位信号；以往认为它们属于细胞质蛋白，只能在细胞质内发挥调节作用[5-6]。最近的研究证明：它们能不依赖p53基因对细胞周期进行调节，能抑制细胞生长、迁移等；另外，由于NF-κB、HPH-2同样存在于细胞质内，因此，研究推测它们与ING4 胞质内的剪接变体可能存在相互作用，这一点需要进一步的证实[1]。

    2    ING4基因在肿瘤及细胞系中的表达

    ING4 及其他ING家族成员均被认为是第二级的肿瘤抑制基因，极少发生变异，在多种肿瘤中表现为ING4转录水平下降及ING4所在12p13区的杂和性丢失，如约76%的头颈部原发性肿瘤，5%~26%的儿童急性成淋巴细胞白血病，12%~43%的前列腺肿瘤。26%的卵巢肿瘤及10%~20%的原发性乳腺癌等[7-9]。胶质瘤已被证明其恶性程度与ING4 mRNA含量密切相关。研究发现：Ⅳ级胶质细胞瘤中ING4 mRNA的含量较正常脑组织下降6倍，而Ⅱ~Ⅲ级胶质瘤中的含量仅下降2~3倍[5]。

    ING4 基因这种在肿瘤组织中呈杂和性丢失，即单倍型剂量不足 （haploinsufficiency） 现象的原因目前认为有两种可能 [7-8]：一是ING4 上游基因异常，二是ING4 的后生调节 （epigenetic inactivation） 作用造成ING4 mRNA存在失活性改变。这种改变主要表现为两种变异：一种是编码核定位信号区 （KGKK） 的279~290位核苷酸发生缺失，从而造成ING4 蛋白不能定位于细胞核内，影响其功能的发挥，有报告显示ING4 的同源蛋白ING1在脑肿瘤与侵袭性乳腺癌中存在类似的情况[10-11]；另一种变异为单个核苷酸 （465C、446A） 缺失，这种变异可引起翻译时读码框的改变，造成所翻译的ING4 蛋白出现C末端平截，ING4 蛋白分子的一半 （包括高度保守的PHD区） 被截去。近来有报告称这种经过C末端平截的ING4 蛋白能够发挥显性负效应，能阻止正常的ING4 蛋白发挥作用[5，8]。

    此外，12p13区的基因组成实际上还存在另外两种肿瘤抑制基因，即TEL/ETV6与p27KIP，这两种基因在上述肿瘤的发生过程中所起的作用至今未明。因此，明确ING4、TEL/ETV6与p27KIP的基因定位并进行功能检测，具有重要意义[5，8]。

    3    ING4 的抗肿瘤作用

    3.1    肿瘤血管的生成    新生血管增多是肿瘤恶变过程中必需的环节，如何抑制肿瘤血管的生长，是目前肿瘤治疗领域一个热点。近年研究证实：NF-κB是人体一种重要的转录因子，调控包括IL-8在内的多种基因的转录表达，参与人体对免疫应答、细胞寿命调节、血管生成及肿瘤的发生与转移等多个环节。而IL-8可通过诱导内皮细胞的趋化与增生来介导肿瘤组织的新生血管化。Shi等[5]对活体内U87MG胶质瘤细胞系血管生成的研究表明：ING4 可以与NF-κB的p65亚基发生结合，从而抑制NF-kB转录活性，引起IL-8表达水平下降 （从780 pg/mg降至80 pg/mg），导致肿瘤血管生成减少，具体表现为血管密度降低及血管直径缩小，从而明显抑制胶质瘤血管的生成。但也有研究表明：ING4 可通过抑制低氧诱导因子 （HIF） 的活性，减少IL-8的表达，抑制肿瘤血管的生成[12]。目前对何种机制起主导作用，尚不清楚。

    3.2    缺氧状态的适应    氧反应途径是组织细胞为适应缺氧状态而产生的保护自身正常结构功能的一种生理反应。低氧诱导因子 （hypoxia inducible factor，HIF） 是该反应途径的关键因子，其靶基因主要参与调节组织的代谢、氧的转运、血管的生成以及细胞寿命等。细胞内缺氧可诱导HIF的表达，而HIF对其靶基因的继发性转录可促进细胞对缺氧环境的适应。肿瘤组织因其快速增长及血管系统扭曲，常导致肿瘤内部处于缺氧状态。肿瘤组织中HIF升高的水平常与肿瘤的侵袭性、治疗抗性及病人的病死率密切相关，因此，低氧反应途径被认为是肿瘤生长过程中重要的促进因素[13]。HIF脯氨酰羟化酶 （HPH）-2 （HPH-2） 是HPH家族的成员，该家族在氧含量正常的情况下，将HIF的α亚基需氧降解区内高度保守的脯氨酸残基羟基化，从而使HIF快速降解，抑制低氧反应途径的发生。由于HPH-2要以氧气作为底物，因此被认为是低氧反应途径中氧含量的感受器[14]。Ozer等[15]研究发现：ING4不仅能够明显抑制缺氧状态下HIF靶基因 （如Nip3，AK3等） 的表达，而且能通过自身191~249位氨基酸，尤其是PHD区与HPH-2的C末端结合形成复合物。而这两种过程既不伴HIF量的改变，又不影响HPH-2的活性。当ING4 受到抑制时，HIF靶基因的表达会较对照组上升2~3倍。由于研究中并没有发现ING4 与HIF有直接的作用关系，加上ING家族蛋白多与染色体改建因子存在相互作用[16]，因此，仅能推测在缺氧环境下，HPH-2对HIF-α亚基的识别能够通过ING4，将染色体改建因子聚集到HIF应答基因的启动子区，最终抑制HIF对其靶基因的转录。又由于HPH家族的C末端与ING家族的PHD区均为高度保守序列，因此，HPH家族与ING家族之间可能存在交叉反应。

    3.3    接触抑制的丢失以及软琼脂内非贴壁性生长

    接触抑制的丢失与细胞在软琼脂内非贴壁性生长被认为是体外研究中正常细胞恶性转化的重要标志，但其发生机制至今未明。myc原癌基因产物是正常细胞生长所必需的一种转录因子，它能调控1 500多种基因的转录，参与细胞生长周期的调节，其过度表达可诱导细胞生长过程中接触抑制的丢失。研究发现ING4 并不影响myc对细胞的促生长作用，正常细胞系的生长也不受ING4 的抑制，它仅阻止myc诱导接触抑制丢失现象的发生[8]。由于ING4 并不是诱导接触抑制现象的基因，因此ING4 可能通过调控某些基因的转录，例如编码细胞间连接复合体的基因来维持接触抑制状态的存在[17-18]。T47D乳腺肿瘤细胞系中ING4呈明显缺乏，但该细胞系仍能保持生长中接触抑制的存在，这也印证了上述推断[8]。但目前对上述现象的分子机制尚不明了，一般认为，ING4 通过染色体的改建来发挥基因转录的调控作用。此外，Kim等[19]在研究中还发现：ING4 能够抑制T47D细胞在软琼脂中的非贴壁性生长，由于该细胞系中p53基因缺陷，因此该作用是以不依赖P53的机制发生的。

    3.4    细胞生长周期的调节与凋亡    近年来的研究证实：ING4 能通过上调p53的转录活性，打乱正常的细胞周期进程，使细胞生长停滞，促进细胞凋亡。如Shiseki等[3]利用RKO细胞系进行研究发现：ING4 的表达能够减少处于S期的细胞，上调G1-S与G2-M期的细胞群落，抑制RKO细胞系集落的形成，促进RKO细胞的凋亡，而在P53失活的RKO-E6细胞中未见上述变化；而王金志等[17]则发现ING4 的表达并未减少S期的细胞数目，而是表现为G2-M期阻滞，且阻滞程度与ING4 的量密切相关。一般认为，对P53功能的调节有两种可能途径：一是其他蛋白与P53直接发生作用，是对P53蛋白翻译后的修饰。ING4能与P53直接结合，其核定位信号 （NLS） 在该过程中起关键性作用，如果NLS区发生突变，ING4 将不能与P53结合，且ING4 对P53活性的上调作用也将消失[2]。另外，研究中亦发现，ING4能促进P53第382位脯氨酸的乙酰化，但其意义目前还不确定，有研究发现P53的乙酰化并没有改变其特异性结合DNA的氨基酸序列，因此P53乙酰化可能是通过其他机制来调节P53的功能。组蛋白乙酰转移酶 （HAT） 与组蛋白脱乙酰基酶 （HDAC） 不但能作用于组蛋白的脯氨酸残基，使染色体发生改建，也能作用于某些细胞蛋白。因此，ING4可能在P53与HAT间起桥梁作用，从而促进P53的乙酰化。由于研究中发现，只有那些具有染色体结构的p53应答基因的表达能够被ING4强化，因此，目前推断ING4可能是将转录共激活因子 （如HAT复合物） 或转录的抑制因子 （如HDAC），与p53一起聚集于p53应答基因的启动子区，诱导染色体的改建，调节p53应答基因的转录活性[2]。

    3.5    增强化疗药物的敏感性    有研究发现：ING4的表达能够提高肿瘤细胞对DNA损伤因子的化学敏感性，但机制尚不明了[20]。

    3.6    抑制肿瘤细胞侵袭转移    liprin α1是形成黏着斑所必须的一种胞质蛋白，能促进细胞迁移运动。细胞质ING4可与该蛋白相互作用，抑制细胞的伸展移行，从而对肿瘤的侵袭转移起抑制作用[20]。

    4    结    语

    ING4是一种新发现的肿瘤抑制基因，参与肿瘤血管的生成、细胞缺氧状态的适应、细胞接触抑制的丢失以及细胞凋亡与生长周期调节等肿瘤发生、发展的多个过程。由于目前ING4的研究只是刚刚起步，现有的成果还处于起始阶段，ING4诱导染色体改建的分子机制、细胞质剪接变体的具体作用以及ING家族与HIF家族的关系等许多相关问题尚不清楚。因此，进一步研究ING4的抗肿瘤机制，为我们认识肿瘤的发生、发展过程，以及为未来的肿瘤基因治疗提供新的思路和线索，也将对以ING4为靶点的肿瘤基因治疗的临床应用提供坚实的理论基础。

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