NOTCH-1 信号通路对人脑胶质瘤干细胞增殖和分化作用的研究

作者：于春泳， 尹昌林， 吕胜青， *杨辉    作者单位：中国人民解放军第三军医大学新桥医院神经外科， 重庆 400037       【摘要】目的 研究NOTCH-1 信号通路对人脑胶质瘤干细胞增殖和分化的作用及意义。 方法 应用免疫磁珠法从人脑胶质瘤组织标本和胶质瘤细胞株中提取、分选胶质瘤干细胞，进行体外培养；应用免疫组织化学、免疫荧光双标法方法和RT-qPCR法分别检测其增殖、分化过程中NOTCH-1信号通路中关键基因和蛋白的表达情况。 结果 人脑胶质瘤组织中存在胶质干细胞。NOTCH-1在CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中均可表达，在CD133阳性细胞中最显著。胶质瘤干细胞增殖过程均能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1、CBF-1和HES-1的mRNA表达，在胶质瘤干细胞分化时，表达逐渐减弱。 结论 NOTCH-1基因在人脑胶质瘤中高表达；NOTCH-1信号通路参与了胶质瘤干细胞增殖、分化过程，为人脑胶质瘤治疗的新靶点提供了依据。

       【关键词】  神经胶质瘤 干细胞 信号传导

       NOTCH-1 signaling pathway regulates proliferation and differentiation of human brain glioma stem cells YU Chunyong, YIN Changlin, LV Shengqing, et al.Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

       Abstract:  Objective  To investigate effect and significance of NOTCH-1 signaling pathway on proliferation and differentiation of human brain glioma stem cells (BGSCs).  Methods  Specimens of glioma were obtained from patients undergoing microsurgical tumor resection. BGSCs were isolated from these tumor specimens and sorted by magnetic activated cell sorting, and then cultured and proliferated ex vivo. The expressions of the key gene and protein in the NOTCH-1 signaling pathway in the course of proliferation and differentiation were detected by immunocytochemistry, immunofluorescence double labeling and RT-qPCR.  Results  BGSCs existed in human brain glioma tissue. NOTCH-1 was found in CD133+、MAP2+、GFAP+ and MBP+ cells, especially in group CD133+. The mRNAs of NOTCH-1, CBF-1 and HES-1 were detected during the proliferation, and weakened during the differentiation.  Conclusion  There is a high level expression of NOTCH-1 in human gliomas. NOTCH-1 signaling pathway takes part in proliferation and differentiation of BGSCs and may be a new target for glioma therapy.

       Key words:  glioma;  stem cells;  signal transduction               胶质瘤是临床最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，疗效差，平均生存期短。近年从脑胶质瘤组织中分离出了脑胶质瘤干细胞[1-3]，被认为在胶质瘤的发生、发展和复发中起决定性作用[4]。本实验选择人脑胶质瘤干细胞作为细胞模型，研究NOTCH信号通路对胶质瘤增殖、分化的作用，有助于阐明调控胶质瘤发病的机制。

       1    材料与方法

       1.1    实验材料    人脑胶质瘤新鲜标本62 例，取自我科2005年9月～2007年3月的胶质瘤手术病人。WHO分级Ⅰ～Ⅱ 级 （低度恶性胶质瘤） 28 例，Ⅲ～Ⅳ级 （高度恶性胶质瘤） 34 例。正常新鲜脑组织标本9 例作为对照组 （取自我科同期脑外伤行颅内减压手术病人）。U251恶性胶质瘤细胞株为我科吕胜青副教授惠赠，CHG-5胶质瘤细胞株由我校病理研究所姚晓红博士惠赠。

       1.2    实验方法

       1.2.1    脑胶质瘤干细胞的分离、培养和鉴定：    用免疫磁珠法对胶质瘤新鲜标本及U251、CHG-5细胞株进行分选。分离获得的脑胶质瘤干细胞按1 × 105个细胞/50 ml培养瓶，分别加入无血清培养和有血清培养液，37 ℃、5% CO2、95%湿度孵箱内进行增殖培养，每2 d添加1次新鲜细胞因子，每4~6 d传代1次。培养2 h后行抗CD133和抗Nestin免疫荧光双标染色，激光共聚焦显微镜观察。

       1.2.2    NOTCH-1信号通路蛋白表达的检测：    将人脑胶质瘤组织和正常人脑组织冰冻切片，用SABC法，采用SP-9003免疫组化染色试剂盒 （ZYMED 公司生产，中杉金桥公司代理），确定标本为阳性表达后，利用Leica Qwin 图像分析软件 （德国） 进行图像分析，测定累积光密度 （Integrated Optical Density，IOD）。在预先用多聚赖氨酸处理过的干净盖玻片上培养U251胶质瘤细胞，进行NOTCH-1 信号通路蛋白和4 种肿瘤细胞的标志物 （CD133、MAP2、GFAP、MBP） 免疫荧光双标染色，激光共聚焦显微镜观察。

       1.2.3    RT-qPCR检测NOTCH-1信号通路关键基因的表达：    按照Roche公司产品说明提取胶质瘤干细胞RNA，设计各目的基因引物，由上海生物工程有限公司合成。序列如下：NOTCH-1 （273 bp） 上游引物序列：5'-CTCCCCGTTCCAGCAGTCTC-3'，下游引物序列：5'-CAGCCACTCGCATTGACCAT-3'；CBF-1 （128 bp） 上游引物序列：5'-TTCCACCAGCCTTACCT TTACCTAC-3'，下游引物序列：5'-CCTCGCTGTTTGT GTTTGATTCGT-3'；HES-1 （169 bp） 上游引物序列：5'-AGGCGGCTAAGGTGTTTGGAGG-3'，下游引物序列：5'-GGCCGCTGGAAGGTGACACTG-3'；GAPDH （159 bp） 上游引物序列：5'-ACCCATCACCATCTTC CAGGAG-3'；下游引物序列：5'-GAAGGGGCGGAGA TGATGAC-3'。应用定量PCR仪自带数据分析软件进行相应分析。

       1.3    统计学处理    数据均以x ± s表示，采用SPSS 10.0统计软件，组间多重比较采用S-N-K检验。

       2    结果

       2.1    胶质瘤干细胞的培养、鉴定

       2.1.1    生长情况：本组人脑胶质瘤干细胞培养成功7例，CD133表达阳性。在无血清培养基中，CD133+细胞群中大部分细胞呈悬浮生长，培养24～48 h，细胞聚集生长形成肿瘤球；随时间增加，肿瘤球体积增大，形状较规则，边缘光滑，细胞形态清楚，呈圆形，无明显突起。将肿瘤球转入含10%胎牛血清的培养基中培养， 2 h左右沉降贴壁，4 h后周边细胞伸出突起，随后肿瘤球周边细胞开始向外迁移，伸出突起；24 h后肿瘤球变扁，形状不规则，迁移出的细胞增多，并以原肿瘤球为中心向四周呈放射状排列 （图1）。肿瘤球中心位置细胞仍呈未分化状态，而迁移出的细胞形态多样，异质性明显，开始分化，不具有成熟神经元或胶质细胞的典型形态特征，但其表型与未分选前有血清培养的肿瘤细胞一致。

       2.1.2    鉴定： CD133+胶质瘤细胞所形成的肿瘤球能同时表达干细胞标志物CD133和Nestin，但表达Nestin的细胞数目及强度均高于CD133；表达Nestin较强的细胞主要分布于肿瘤球表面 （图2）。

       2.2    NOTCH-1信号通路蛋白的表达

       2.2.1    NOTCH-1表达情况及与胶质瘤恶性程度关系：    测定蛋白表达IOD值，低度或高度恶性胶质瘤组织表达均明显强于正常成人脑组织 （346.25 ± 86.75） （P ＜0.01），其中高度恶性胶质瘤 （10 757.41 ± 1 622.07） 表达最强，与低度恶性胶质瘤 （7 024.02 ± 1 075.32） 的表达水平有显著差异 （P ＜0.01）。

       2.2.2    人脑胶质瘤细胞株U251中NOTCH-1的表达：    U251细胞株中包含干细胞标志物CD133+细胞，也包括分化较成熟的胶质瘤细胞标记物GFAP+、MAP2+、MBP+细胞。免疫荧光双标染色结果显示：NOTCH-1信号通路蛋白NOTCH-1在CD133+细胞表达最强，在GFAP+、MAP2+细胞中表达有强有弱；在MBP+细胞中呈弱表达或不表达 （图3~6）。

       2.3  脑胶质瘤干细胞增殖过程中NOTCH-1 信号通路相关基因mRNA的表达 （表1）    以同株胶质瘤中分离获得的CD133-胶质瘤细胞为参照，收集4株胶质瘤细胞，其中第1例为女性病人，51岁，病理为多形性胶质母细胞瘤Ⅳ级，标记为P1 （+）；第2例为男性病人，37岁，病理为星型细胞瘤Ⅱ级，标记为P2 （+）；U251细胞株标记为U251 （+）；CHG-5细胞株标记为CHG-5 （+）。进行RT-qPCR检测，发现NOTCH-1 信号通路中关键基因NOTCH-1、CBF-1和HES-1在CD133+中表达较强。

       2.4    脑胶质瘤干细胞分化过程中NOTCH-1 信号通路相关基因mRNA的表达 （表2）    本研究以同株胶质瘤中分离获得的CD133-胶质瘤细胞作为参照，收集4株胶质瘤细胞 [P1 （+）、P2 （+）、U251 （+）、CHG-5 （+）] 进行检测，发现随着对脑胶质瘤干细胞的诱导分化，NOTCH-1 信号通路关键基因表达水平逐渐下降，NOTCH-1、CBF-1、HES-1基因的mRNA表达在3 d时最高，7 d时表达水平明显下降，但仍高于CD133-对照组。

       3    讨论               脑胶质瘤是中枢神经系统治疗效果最差的肿瘤之一，其治疗的最大困难在于复发，这与胶质瘤细胞的增殖能力和侵袭性生长有关，只有不到5%的脑胶质瘤病人的生存期能达到5年[5]。目前一般采用外科手术、放疗、化疗、免疫治疗及综合治疗等措施，但治疗效果不佳。因此，针对胶质瘤的发病机制寻找新的治疗靶点并探索新的治疗方法具有重要的理论意义和实用价值。近年，基因治疗逐渐成为研究的热点[6]。选择合适的作用靶点和载体系统是其中最关键的两个环节。               NOTCH 基因发现于1919年，其突变可造成果蝇的残翅。NOTCH 表达于无脊椎动物到脊椎动物的多个物种中，其家族成员的结构具有高度保守性。其中NOTCH-1 不仅对正常细胞发育起重要作用，而且与一些肿瘤的发生、发展相关[7]。Stockhausen等[8]报告胶质母细胞瘤细胞系均表达不同水平的NOTCH-1。Fan等[9]发现NOTCH信号通路的关键基因HES-1在髄母细胞瘤表达情况与病人预后相关。               NOTCH信号由两个邻近细胞的NOTCH受体与配体结合导致受体构象改变，暴露受体胞外区的金属蛋白酶切割位点，发生蛋白水解作用，释放出NOTCH的胞内段 （NOTCH intracellular domain，NICD），NICD转移至细胞核内，与转录抑制因子RBP2Jκ （也称CBF-1） 结合；CBF-1与NICD结合并招募共活化物后，即成为转录活化因子，活化HES等分化拮抗基因的转录，表达产物与相应的分化效应基因的启动子特异性结合，阻碍细胞特异性分化，最终影响细胞的增殖、分化和凋亡。通过实验，我们从不同病理类型的新鲜胶质瘤标本中提取出CD133+胶质瘤细胞，仅占肿瘤细胞总体的小部分，能表达干细胞的标志物CD133和Nestin，体外培养能连续传代；具有多向分化潜能：诱导分化后能产生MAP2、GFAP、MBP染色阳性的细胞；因此，这部分CD133+细胞就是胶质瘤干细胞。               检测胶质瘤细胞株表明：NOTCH-1信号通路蛋白在CD133、MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中均可表达，但在CD133阳性细胞中表达很强，而在发育较成熟的MAP2、GFAP和MBP阳性细胞中表达减弱或极弱 （检测不到）。NOTCH信号通路的关键蛋白分子NOTCH-1在脑胶质瘤组织和细胞株中均有表达，而正常成人脑组织中仅能检测到微弱的表达；NOTCH-1在高级别胶质瘤中的表达高于低级别胶质瘤，提示NOTCH-1信号通路与胶质瘤的发生和恶性程度有关。进一步以胶质瘤干细胞为模型，发现在胶质瘤干细胞增殖过程中均能检测到较强的NOTCH-1信号通路关键基因NOTCH-1、CBF-1和HES-1的mRNA表达，提示NOTCH-1信号通路的强表达参与了脑胶质瘤干细胞增殖状态的维持；而在胶质瘤干细胞分化时NOTCH-1信号通路的上述关键基因mRNA表达逐渐减弱，提示NOTCH-1信号通路表达减弱，胶质瘤干细胞走向分化。               NOTCH-1、CBF-1和HES-1分别为NOTCH信号通路中上游的启动基因、下游的关键调控基因和靶基因[10-11]，在胶质瘤干细胞的增殖过程中高表达，使胶质瘤干细胞处于增殖状态；在胶质瘤干细胞的分化过程中，这些关键基因的表达减弱，使胶质瘤干细胞分化为较成熟的细胞，胶质瘤干细胞的增殖被抑制。NOTCH信号通路中的这些关键基因调控了胶质瘤干细胞的生长，从而影响了胶质瘤的发生、发展及预后。由此可以预见，将NOTCH-1信号通路作为脑胶质瘤治疗的新靶点，通过对NOTCH信号通路中这些关键基因调控胶质瘤干细胞的研究，可以为胶质瘤的治疗提供新的方向。

       【参考文献】        [1] SINGH S K, CLARKE I D, TERASAKI M, et al. Identifi- cation of a cancer stem cell in human brain tumors [J]. Cancer Res, 2003, 63(18): 5821-5828.

        [2] SINGH S K, HAWKINS C, CLARKE ID, et al. Identifi- cation of human brain tumor initiating cells [J]. Nature, 2004, 432(7015): 396-401.

        [3] 姜晓兵, 周凤, 姚东晓, 等. 人脑胶质瘤干细胞的培养及鉴定 [J]. 脑与神经疾病杂志, 2005, 13(1): 6-8.

        [4] 尹昌林. 脑胶质瘤干细胞的研究进展及应用前景 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2006, 11(8): 370-373.

        [5] CLAUS E B, BLACK P M. Survival rates and patterns of care for patients diagnosed with supratentorial low-grade gliomas: data from the SEER program, 1973-2001 [J]. Cancer, 2006, 106(6): 1358-1363.

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        [8] STOCKHAUSEN M T, SJOLUND J, MANETOPOULOS C, et al. Effects of the histone deacetylase inhibitor valproic acid on Notch signalling in human neuroblastoma cells [J]. Br J Cancer, 2005, 92(4): 751-759.

        [9] FAN X, MIKOLAENKO I, ELHASSAN I, et al. Notch1 and Notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth [J]. Cancer Res, 2004, 64(21): 7787-7793.

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