阿尔茨海默病的免疫治疗进展

　　作者：方运勇 莫建伟 作者单位：(广东省医学科学院广东省人民医院东病区神经内科,广东 广州 510080)

　　【关键词】 阿尔茨海默病;免疫治疗;β淀粉样蛋白;抗Aβ抗体

　　阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆能力减退、认知功能障碍、行为异常为临床特征的神经退行性疾病。常发病于60岁以后，85岁以上患病率可高达25%～30%〔1〕。其显著的病理特征之一为患者脑内产生由42个氨基酸构成的β淀粉样蛋白(Aβ)。研究发现Aβ可能是AD发病机制的起始因素和关键环节〔2，3〕。因此减轻脑内Aβ的负荷，阻止和逆转Aβ的纤维化和沉积成为预防和治疗AD 的一种有效方法。近来，免疫治疗在这方面的作用越来越引起学者的重视。

　　1 Aβ的形成及代谢

　　Aβ是I型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的酶解产物。脑内APP有两条代谢途径〔4〕，一条是正常的不产生Aβ的代谢途径，APP主要由α分泌酶水解，生成可溶性蛋白αAPPs和C83，前者对神经元的损伤具有保护作用，调节神经元的可塑性和存活，后者在γ分泌酶作用下，进一步降解为P342或P340，这是APP代谢的主要途径。另一条是Aβ途径，当编码APP的基因发生突变或其他原因导致β分泌酶活性异常增高时，APP首先经β分泌酶水解生成βAPPs和C99，后者再在γ分泌酶作用下，降解成由3943个氨基酸残基构成的Aβ。正常情况下Aβ的产生和降解保持平衡〔5〕。但在AD患者脑内这种平衡被破坏， Aβ从可溶状态到自身聚集再到不溶状态，并沉淀形成老年斑。这个过程是AD发病机制中的关键环节〔6〕。关于 Aβ的作用既往有两种观点：一是认为Aβ沉淀可以引起患者神经组织退化;另一观点则认为Aβ沉淀形成老年斑仅仅是神经细胞损伤导致的结果，而不是发病的先决条件〔7〕。近年来，大多数研究〔8〕认为，Aβ毒性机理与氧自由基引起的氧化应激、细胞内钙稳定失调以及由此引起的细胞凋亡有关。

　　2 AD免疫治疗概述

　　1999年Schenk等〔9〕用聚集的Aβ42加弗氏佐剂接种PDAPP(expressing mutated human amyloid precursor protein under plateletderived growth factor promotor)转基因鼠，诱导产生了抗Aβ抗体，减轻了PDAPP鼠脑内AD样病理变化，并认为抗Aβ抗体的产生是老年斑得以清除的前提。此后发现用Aβ免疫可以改善AD转基因鼠的学习和记忆功能〔10，11〕。 McLaurin等〔12〕发现，免疫后的抗血清可有效抑制Aβ的纤维聚集，且能减轻淀粉样蛋白对PC12细胞的毒性作用，其他研究也证明了免疫手段在AD预防和治疗中的作用。并逐渐应用于临床试验当中。

　　2.1 免疫治疗AD的作用机制 许多研究表明，免疫治疗能够清除Aβ沉积，应用抗Aβ抗体治疗AD可以减缓甚至逆转疾病的进程。然而，目前对于免疫治疗清除Aβ的机制存在多种学说:第一，外周池假说(the peripheral sink hypothesis)〔13〕，认为抗体不进入中枢神经系统而与外周血中的Aβ分子结合并沉淀下来,从而改变了Aβ蛋白在神经中枢系统和血液中的动态平衡,使神经中枢系统中过多的Aβ蛋白主动转运到外周，最终减轻神经中枢的Aβ负荷,从而达到治疗目的。该观点被多数学者所接受。第二，提出抗体Fc片段介导的胞吞作用。抗Aβ抗体穿过血脑屏障，与脑内Aβ特异性结合，激活小胶质细胞，调理其吞噬、清除Aβ〔9〕。Bard等〔14〕观察到，抗体与小胶质细胞Fc受体亲和力越高，其清除斑块的能力越强，而补体系统的激活不是清除老年斑所必需的。这表明Fc受体介导的抗体清除老年斑的途径是高效能过程。但也有研究发现,缺少Fc段的单链抗体也具有清除Aβ沉积的能力〔15〕。第三,抗体直接结合Aβ多聚体(纤维和/或寡聚体)，导致Aβ多聚体解离,抑制Aβ纤维的形成。Solomon等〔16〕研究表明抗体直接与脑内Aβ结合，抑制Aβ分子之间的相互作用，使之不能形成纤维，阻断Aβ的突触毒性作用，促进清除。第四，近来,有学者根据实验结果提出了Aβ抗体可促进胞内Aβ片段清除的观点〔17，18〕。认为Aβ抗体与细胞膜表面APP的Aβ区域结合,加速了APP内吞,存在于内体囊泡中的抗体增强了APP裂解产物的降解,从而使细胞内Aβ含量降低,达到减少Aβ蛋白含量的目的。

　　亦有学者认为以上几种机制之间是相互协调发挥作用的〔19〕。Wilcock等〔20，21〕通过将抗Aβ抗体注射入Tg2576鼠颅内，观察了Tg2576鼠脑内Aβ清除过程，其结果显示Aβ的清除分为两个阶段：第一阶段，没有小胶质细胞的激活，发生在抗体注射后4～24 h内，主要清除一些弥散的Aβ;第二阶段，抗体注射后1～3 d，主要清除聚集的Aβ，此清除过程有激活的小胶质细胞参与。抗Aβ天然抗体(native antibody)及其相应的去糖基化抗体(与小胶质细胞表面Fc受体亲和力很低)都能减少脑内Aβ负荷，也说明Aβ抗体对Aβ的清除不一定需要小胶质细胞的参与〔22〕。上述研究提示抗体进入体内不同时期，其清除Aβ的机制可能是不同的。总之抗体清除淀粉样蛋白的机制比较复杂，需要进一步深入探讨。

　　2.2 主动免疫治疗研究 免疫治疗AD研究中，疫苗接种是首选的方法。主动免疫治疗的本质是应用自身的蛋白质作为抗原免疫机体，以达到清除体内异常构象蛋白质的目的。Schenk〔9〕等报道Aβ142对PDAPP转基因鼠进行主动免疫产生了高滴度的抗Aβ抗体，阻止了转基因鼠认知功能的减退。此后Check用合成Aβ142加佐剂QS21制成的抗原AN1792进行主动免疫疗法一期临床试验，成功免疫80名健康成年志愿者和部分家族性AD患者。随后在美国和欧洲开始了以轻中度AD患者为对象的二期临床试验。临床试验过程中由于300例用抗原AN1792治疗的患者中有18例(6%)患者出现了脑膜炎，而安慰剂组未出现类似的病例，因此临床试验被终止〔23〕。尸体解剖结果显示，与未免疫的AD患者脑组织相比较,免疫后病人脑组织各区域的Aβ沉积斑消失或稀少,其他的一些病理学改变与对照并无差别。Head在为其两年的对老龄狗动物模型的研究中也证实了这一点〔24〕，该研究发现皮质的淀粉样蛋白减少了80%，然而伴随淀粉样蛋白的减低并没有出现相应的复杂学习、空间记忆的明显改善。尸体解剖还在软脑膜、脑皮层和血管周围空隙中发现有T淋巴细胞(主要为CD4+和一些CD8+)的渗入，大量巨噬细胞渗入白质，以及脑内出现包含Aβ的小胶质细胞。这可能是由于Aβ疫苗在刺激机体产生针对脑中Aβ特异性抗体的同时,也激活了Aβ特异的细胞毒性T细胞,引起细胞免疫反应，被激活的T细胞可以引起一系列的级联反应,破坏血脑屏障的保护作用,使外周循环中的抗体进入中枢神经系统,产生炎症及脑损伤.这就为今后疫苗的设计提出了新的要求，新制作的疫苗需要避免这种T淋巴细胞介导的免疫反应而只产生纯粹的体液反应。最近，有研究人员应用非病毒DNA免疫接种于AD动物模型未发现有副作用，在这个实验当中也观察到Aβ的清除有赖于抗体Fc片断介导的小胶质细胞的吞噬作用〔25〕。目前大多数研究都是使用各种转基因小鼠作为AD动物模型来评价免疫治疗效果及疫苗的安全性,但由于小鼠的血脑屏障的结构以及产生抗体的类型与人类存在差异,无法完全模拟人体的真实状况,在转基因小鼠模型的实验研究中并没有发生人体试验中所出现的自身免疫反应性脑炎以及脑萎缩等并发症,因此，使用与人类遗传更加接近的灵长类动物进行AD免疫治疗效果及安全性的评估会更准确，更具说服力。有学者就应用Aβ142衍生物和Aβ142分别接种老龄狐猴，并观察体内产生抗Aβ抗体的情况，结果显示在狐猴体内均产生了实质性的抗Aβ抗体，Aβ142衍生物接种组抗体水平相对平稳，在停止免疫接种后，抗体水平回到基线水平，而对照组接种Aβ142后产生较强的抗体反应，且治疗停止后狐猴体内IgG水平不会回到基线水平。该研究表明：接种Aβ142衍生物后体内产生抗体是可逆的，多次应用后无脑内沉积及细胞毒性的危险，增强了疫苗的安全性〔26〕，为以后AD的主动免疫治疗提供依据。当然目前这些研究只是处于实验阶段，安全地用于人体还需进一步研究。

　　2.3 被动免疫治疗研究 Solomon等〔16〕于1996年报道了抗Aβ42抗体在体外能够阻止Aβ42纤维化、解聚已聚集的Aβ42和保护PC12细胞免受Aβ42的细胞毒性作用;并认为脑内抗体结合可溶性Aβ42的同时可阻断可溶性Aβ42向不溶性Aβ42的转变，从此开启了被动免疫治疗AD的研究。许多研究采用不同形式的抗体，以不同途径注入实验对象体内进行了一系列的观察。Bard等〔27〕用抗Aβ单抗(10D5、3D6)经腹腔注射到PDAPP转基因小鼠，6个月后处死小鼠，其脑组织冰冻切片与小胶质细胞一起孵育24 h，经过免疫染色观察到外源小胶质细胞可以吞噬斑块中的Aβ纤维，而对照组，斑块保持完整未见小胶质细胞的吞噬现象。De Mattos等〔28〕将抗Aβ单克隆抗体m266经外周静脉注入仅能在脑组织中表达APP的PDAPP转基因小鼠体内，结果显示血浆中Aβ浓度增高1 000倍，脑组织中Aβ蓄积明显减少，说明抗体能中和外周循环中的Aβ，使脑内的Aβ逐步扩散入血液中而被清除。Chauhan等〔29，30〕将抗体直接注射到小鼠的第三脑室中，并且在注射后不同时间段检查小鼠的大脑组织，结果表明，到第4周，治疗组淀粉样蛋白的密度比没有注射抗体的对照组小鼠减少了67%。Levites等〔31，32〕发现，抗Aβ140及Aβ142的单克隆抗体注入APP转基因小鼠体内后，脑内淀粉样斑块总量减少50%左右。进一步研究发现抗体m266治疗PDAPP小鼠可以快速和完全恢复海马乙酰胆碱释放及高亲和力胆碱的吸收，同时减少了这些小鼠的学习功能损害〔33〕。

　　被动免疫治疗的弊端之一就是需要多次反复注射，多次使用会导致免疫反应。有研究者用单次剂量的抗Aβ抗体注射入AD模型观察到，模型脑组织的神经细胞发生形态学改变，单次剂量免疫治疗后30 d，大脑中的老年斑没有明显减少，但老年斑周围营养不良神经细胞减少了，神经突触密度增加了，老年斑周围的轴突恢复其正常的弯曲度。该结果提示单次剂量注射抗Aβ抗体进行免疫治疗能对皮质神经元的形态产生长久的益处，但同时也提示：老年斑持续存在的情况下，神经回路也是有可塑性的〔34〕，这为以后被动免疫治疗研究提供了依据。另有研究发现被动免疫治疗能迅速增加受损神经细胞的结构适应性，使神经回路的功能得以恢复〔35〕。被动免疫虽较主动免疫安全,但与许多其他疾病的抗体治疗一样,也有其缺陷。难于制备、成本昂贵等制约了其应用。

　　综上所述，被动免疫治疗AD在动物实验研究中是比较成功的。2004年Dodel等〔36〕利用健康人外周血制备的免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin，IV Ig)，对5名AD病人进行6个月的治疗,患者病情均未加重,其中4 人认知功能改善。病人脑脊液中Aβ总浓度显著减少,血液中的Aβ总浓度显著升高，但Aβ142的浓度均没有显著变化。2007年人的IV Ig也通过二期临床试验，抗Aβ抗体治疗AD的研究出现新的曙光。在进行免疫疗法治疗AD研究的同时，也发现AD病人和正常人体内普遍存在着抗Aβ抗体。 Weklser等〔37〕研究结果显示AD病人外周血中的抗Aβ抗体的水平低于健康老人。杨志勇等〔38〕研究结果提示AD患者血清中抗Aβ抗体的免疫特性有某种缺陷，表现为抗体识别Aβ42能力下降。而且，细胞培养结果提示抗体对PC12细胞的保护作用较健康老人也下降，因此推测AD患者体内可能存在着针对Aβ42的免疫耐受。

　　3 结 语

　　近年来国内外在免疫治疗AD方面的研究取得了较大进展,尽管临床试验中少数患者出现了毒副作用,但绝大多数的患者症状得到明显的改善,说明免疫疗法具有一定疗效,抗Aβ抗体的保护作用得到越来越广泛的认同。相信随着对AD发病机制认识的逐渐深入,对免疫治疗作用机制的不断明确,疫苗制备技术的发展,更加可靠的灵长类动物模型的建立，以及评估体系的完善,将来会制备出疗效更好，毒副作用更小的疫苗。免疫疗法将会在AD治疗上有重大突破。

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