声动力疗法对C6胶质瘤细胞的生物效应研究

作者：宋大勇,孟祥喜

作者单位：哈尔滨医科大学附属第四医院神经外科， 黑龙江　 哈尔滨　 150001

   【摘要】  目的　 探讨声动力化学疗法 （SDT） 治疗脑胶质瘤的可能性。 方法　 采用四唑盐比色法，即MTT法测定C6胶质瘤细胞在SDT组、超声组、血啉甲醚 （HMME） 组、对照四组6 h的抑瘤率，流式细胞学 （FCM） 检测四组6 h的凋亡率，透射电镜观察四组6 h亚细胞结构的变化。 结果　 SDT组抑瘤率为77.61%、凋亡率为38.34%，显著增高；超声组也有一定的抑瘤率、凋亡率；HMME组抑瘤率、凋亡率与对照组无明显差别。透射电镜观察对照组、HMME组C6细胞无明显变化，超声组部分细胞呈早期凋亡表现，SDT组细胞呈现凋亡或坏死状态。 结论　 SDT能显著杀伤体外C6胶质瘤细胞，并诱导其凋亡。

【关键词】  超声疗法 血卟啉 神经胶质瘤 肿瘤细胞 培养的

    Biological effect of sonodynamic therapy on C6 glioma cells

    SONG Dayong, YUE Wu, WANG Zhi, et al

    Department of Neurosurgery, Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China

    Abstract: Objective To explore the feasibility of treating brain glioma by sonodynamic therapy (SDT). Methods After cultivation for 6 hours, the inhibition rate, apoptosis rate and the ultrastructural changes of C6 glioma cells were assayed in SDT group, ultrasound group, HMME (hematoporphyrin monomethyl ether) group and control group by MTT, flow cytometry (FCM) and transmission electron microscopy respectively. Results The inhibition rate and apoptotic rate of C6 glioma cells were 77.61% and 38.34% respectively in SDT group, suggesting a significant increase. Ultrasound group also obtained some effects, while HMME group showed no significant difference compared with the control group. Observed under transmission electron microscope, the changes of C6 glioma cells in control group and HMME group were not significant, and early-phase apoptosis was detected in ultrasound group, while the cells in SDT group displayed morphological features of apoptosis or necrosis. Conclusion SDT can kill C6 glioma cells significantly and induce apoptosis of the tumor cells in vitro.

    Key words: ultrasonic therapy; hematoporphyrin; glioma; tumor cells, cultured 声动力疗法 （sonodynamic therapy，SDT）[1]是指超声激活声敏剂，有针对性地杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的治疗方法。其研究现处于实验阶段，效果良好。本实验观察SDT对C6胶质瘤细胞生物效应的影响，探讨SDT治疗胶质瘤的可能性。

    1　 材料与方法

    1.1　 材料及试剂 大鼠C6胶质瘤细胞 （哈尔滨医科大学神经外科研究所提供）、胎牛血清 （天津TBD公司）、RPMI-1640培养液 （Hylone公司，美国）、胰蛋白酶 （AMRESCO公司，美国）、血啉甲醚 （HMME，北京英发康美技术开发有限公司）。

    1.2　 仪器 超声天使多功能治疗仪 （天使科技控股有限公司）、流式细胞仪 （BD公司FACSCALIB型，美国）、酶标仪 （Bio-Rad公司 550型，日本）、透射电子显微镜 （电子公司JEM-1220型，日本）、倒置相差显微镜 （OLYMPUS公司IX70型，日本）、CO2培养箱 （上海Heraeus公司BB5060型）、洁净操作台 （上海力申科学仪器有限公司Hfsate1200型）、离心机 （上海安亭科学仪器厂80-2B型）、微量移液器 （上海安亭微量进样器厂）、96孔培养板 （NUNC公司，丹麦）。

1.3　 方法

    1.3.1　 C6胶质瘤细胞的培养： 将C6胶质瘤细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液的25 ml培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞处于对数生长期时，分组实验。

    1.3.2　 四唑盐比色法 [3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-dipenyl terazolium bromide，MTT法] 检测C6胶质瘤细胞抑瘤率： C6细胞以0.25%胰蛋白酶消化、1 000 r／min离心10 min后，悬浮于RPMI-1640培养液，采用血球计数仪计数，细胞悬液浓度为4 × 104个/ml。微量移液器将细胞悬浮液以每孔200 μl接种于洁净的96孔培养板上，每块培养板中央部位接种8孔，共4块。培养板随机分为四组：①SDT组，即超声+ HMME组；②超声组；③HMME组；④仅加入肿瘤细胞的对照组。SDT组和HMME组各加入HMME ，终浓度为10 μg/ml。各组避光保存2 h后，SDT组和超声组进行频率为1.0 MHz，声强度为0.5 W/cm2，时间为120 s的超声照射。超声照射时培养板底部置于37 ℃墨水浴中，平面超声探头置入水下，垂直距培养板接种细胞1.0 cm处。继续避光培养6 h，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，培养箱中孵育4 h，小心吸弃孔内的上清液，每孔加入150 μl二甲亚砜 （DMSO），振荡10 min。选择波长为490 nm的酶标仪测定各组肿瘤细胞酶光密度值 （OD值），记录大小。计算抑瘤率：抑瘤率 （%）＝（1-测量组OD值／对照组OD值）×100%。

    1.3.3　 流式细胞学检查 （FCM） 测定肿瘤细胞的凋亡率： 贴壁生长的C6胶质瘤细胞，经胰酶消化、离心后，悬浮于RPMI-1640培养液，制成5 ml单细胞悬液，放入直径1.0 cm的10 ml玻璃试管中，分组、SDT处理同1.3.2，每组8管。四组均继续避光培养6 h，离心，弃上清收集细胞，PBS洗涤2次，75%酒精固定，制备5 × 106的单细胞悬液1 ml，4 ℃放置24 h，加样入流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率。

    1.3.4　 透射电镜检查观察C6胶质瘤细胞的亚细胞结构变化： C6胶质瘤细胞的单细胞悬液制备同前，分组、SDT处理同1.3.2。四组均继续避光培养6 h，离心，弃上清收集细胞，2.5%戊二醛、锇酸双重固定，梯度酒精脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，超薄切片，电子染色，透射电镜观察、照相。

    1.4　 统计分析方法 实验数据以x ± s表示，采用非参数检验，使用SPSSⅡ软件系统进行统计分析，以0.0083为检验水准。

    2　 结 果

    2.1　 MTT法检测C6细胞的抑瘤率 SDT组与另3组比较，抑瘤率明显升高，差异显著 （P ＜0.0083）；超声组抑瘤率亦较对照组高，差异显著 （P ＜0.0083），但较SDT组低。HMME组与对照组比较，抑瘤率无明显差别 （P ＞0.0083）（表1）。

    2.2　 FCM检查结果 SDT组与另3组比较，凋亡率明显升高，差异显著 （P ＜0.0083）；超声组凋亡率亦较对照组高，差异显著 （P ＜0.0083），但较SDT组低。HMME组与对照组比较，抑瘤率无明显差别 （P ＞0.0083）（表1，图1）。

    2.3　 SDT对C6胶质瘤细胞亚细胞结构的影响 透射电镜下，对照组C6胶质瘤细胞胞膜、胞核及亚细胞结构正常 （图2）。HMME组C6细胞与对照组表现类似，未见瘤细胞有损伤表现 （图3）。超声组C6细胞大部分形态结构正常，小部分细胞呈凋亡早期表现 （图4）。SDT组部分细胞呈凋亡表现；还可见部分细胞胞膜呈坏死状态 （图5）。

    3　 讨 论

    光动力疗法 （PDT） 是胶质瘤综合治疗的重要手段之一，SDT与其类似，但很多方面优于PDT[2]：①光的穿透深度浅 （0.1～0.5 cm），而超声波的穿透能力非常强 （5～10 cm），故SDT无需借助其他方法就可以无创杀伤深部肿瘤细胞，适用范围广；②与激光装置比较，用于SDT的超声装置安全简单，造价低。

SDT的抗肿瘤机理至今尚无定论，目前主要有以下两种观点：①单线态氧 （1O2） 机制[2，3]。在SDT过程中可产生1O2，它是一个亲电子性很强的氧化剂，在肿瘤细胞内发生氧化反应，进而杀伤肿瘤细胞；②自由基理论。在SDT过程中产生声敏剂介导的自由基，再与O2反应形成过氧基和烷氧基[4，5]，启动一系列脂膜过氧化反应，对细胞产生杀伤作用。

    很多研究资料显示：声敏剂和超声有相互增效的独特效果，Yumita等[6，7]在体外、荷瘤鼠模型对S180肿瘤细胞行SDT （超声强度3.18 W/cm2，60 s） 的实验表明，单用光敏剂血卟啉 （HP） 没有抗肿瘤效应，SDT和单用超声对体内外肿瘤细胞均有抑制作用，相同条件下，SDT较单用超声对肿瘤细胞的抑制率显著提高。我们首次使用超声治疗仪激活光敏剂HMME，初步对离体C6胶质瘤细胞的SDT效应进行了观察。实验结果表明：SDT能够有效地杀伤体外C6胶质瘤细胞。单用超声对C6胶质瘤细胞也有一定的杀伤作用，但明显低于SDT。单用HMME对C6胶质瘤细胞无杀伤效应。另外，实验也证明HMME是一种效果较好的声敏剂。

    细胞凋亡是脑胶质瘤细胞死亡的重要形式。刘全宏等[8]首次发现SDT能诱导肿瘤细胞发生凋亡，并提出SDT诱导肿瘤细胞凋亡的途径有可能依赖于线粒体结构损伤后释放细胞色素C等，激活Caspase家族蛋白，从而导致细胞凋亡。我们通过FCM检测了SDT对体外C6胶质瘤细胞凋亡的影响，证实了SDT同样可引起C6胶质瘤细胞大量凋亡，凋亡率可达38%。超声也可引起C6细胞凋亡，但凋亡率较SDT组低，而HMME对凋亡无影响，这说明：①SDT诱导C6胶质瘤细胞凋亡是超声和声敏剂协同作用的结果，并非二者作用的简单相加；②凋亡是SDT杀伤C6胶质瘤细胞的重要方式。

    透射电镜结果提示：SDT通过直接损伤和诱导凋亡两种途径显著杀伤C6胶质瘤细胞，与刘全宏等[8]的报道类似。SDT的破坏作用主要表现在：①对细胞膜等生物膜系统的影响。SDT组部分细胞膜消失说明经SDT处理后细胞死亡，而胞膜微绒毛的改变必然影响胶质瘤细胞的分化和增殖。线粒体、核膜等膜细胞器的破损也将影响细胞的内外环境；②对遗传信息表达系统的影响。SDT组部分C6细胞出现核变形、核物质聚集、染色质丢失等均导致基因表达障碍，从而使细胞的正常调控功能丧失，最终导致细胞死亡；③启动了凋亡。本实验SDT组部分C6细胞超微结构呈现凋亡表现，使我们获取了SDT诱导C6细胞凋亡的定性资料。同时，实验也发现超声对C6细胞的胞膜和胞核有一定的损伤，并可诱导其凋亡，但明显弱于SDT。

    由于声敏剂无毒或低毒性与在肿瘤组织的聚集性，及超声的可聚焦性、穿透性和照射部位的选择性，SDT能够选择性地杀伤深部的肿瘤细胞，而对周围健康组织的损害较小,毒副反应也相对较少。在治疗脑胶质瘤领域，对微小病灶、不适宜手术或对传统治疗方法无效的晚期肿瘤病人可能尤为适用。

    （致谢：感谢美国科罗拉多大学医学中心黄正副教授对实验的指导）

【参考文献】  [1] 王君, 韩建涛, 张杨. 肿瘤声动力化学疗法研究现状与展望 [J]. 中国肿瘤, 2003; 12(6): 339-341.

[2] 陈红亮, 张鹏, 张莹, 等. 肿瘤治疗新方法的研究现状与未来 (Ⅱ)—声动力化学在肿瘤治疗中的应用 [J]. 辽宁大学学报(自然科学版), 2001; 28(4): 289-293.

[3] Huang D, Okada K, Komori C, et al. Enhanced antitumor activity of ultrasonic irradiation in the presence of new quinolone antibiotics in vitro [J]. Cancer Sci, 2004; 95(10): 845-849.

[4] Misik V, Riesz P. Free radical intermediates in sonodynamic therapy [J]. Ann N Y Acad Sci, 2000; 899: 335-348.

[5] 刘全宏, 吴二林, 王攀. 声动力学疗法的研究进展 [J]. 陕西师范大学学报(自然科学版), 2005; 33(1): 120-124.

[6] Yumita N, Nishigaki R, Umemura K, et al. Hematoporphyrin as a sensitizer of cell-damaging effect of ultrasound [J]. Jpn J Cancer Res, 1989; 80(3): 219-222.

[7] Yumita N, Nishigaki R, Umemura K, et al. Synergistic effect of ultrasound and hematoporphyrin on sarcoma 180 [J]. Jpn J Cancer Res, 1990; 81(3): 304-308.

[8] 刘全宏, 王攀, 李萌, 等. 声化学激活血卟啉诱导艾氏腹水肿瘤细胞凋亡 [J]. 动物学报, 2003; 49(5): 620-628.