骨桥蛋白表达与垂体腺瘤侵袭性生长的相关性研究
发表时间：2010-02-08 浏览次数：548次
骨桥蛋白表达与垂体腺瘤侵袭性生长的相关性研究作者：姜曙， 唐建建， 王修杰， 毛伯镛 作者单位：四川大学华西医院神经外科， 四川 成都 【摘要】 目的 探讨骨桥蛋白 （Osteopontin，OPN） 表达与垂体腺瘤侵袭性生长的相关性。 方法 分别对78例垂体腺瘤手术标本 （其中侵袭性37例，非侵袭性41例） 和5例来源于尸检的正常垂体组织进行检测，采用实时荧光PCR技术检测组织中OPN mRNA表达，免疫组织化学SP法检测OPN蛋白表达，结合临床资料分析OPN mRNA及其蛋白的表达与垂体腺瘤侵袭性的关系。 结果 侵袭性垂体腺瘤OPN mRNA表达较非侵袭性腺瘤显著增高 （t = 2.43，P ＜0.05）。OPN蛋白表达定位于细胞质，积分光密度 （IOD） 定量检测侵袭性腺瘤为 （55.21 ± 12.07），非侵袭性腺瘤为 （48.83 ± 13.78），两者有显著性差异 （t = 3.44，P ＜0.05）。 结论 OPN mRNA和蛋白在侵袭性垂体腺瘤中表达均增强，提示OPN与垂体腺瘤侵袭性生长过程有关，可能是垂体腺瘤侵袭生长的机制之一，且有望成为新的治疗靶点。 【关键词】 垂体肿瘤； 骨桥蛋白； 肿瘤侵润 Correlation between osteopontin expression and invasive growth of pituitary adenomas JIANG Shu, TANG Jianjian, WANG Xiujie, et al. Department of Neurosurgery, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China Abstract: Objective To explore the correlation between osteopontin (OPN) expression and invasive growth of pituitary adenomas. Methods Samples from 78 patients with pituitary adenomas, including 37 invasive and 41 noninvasive, and 5 normal pituitary tissue specimens from autopsied patients were examined. The expressions of OPN mRNA and OPN were examined by real-time fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) and immunohistochemical SP method, respectively. The relation of OPN and OPN mRNA expressions to invasiveness of pituitary adenomas was analyzed. Results OPN mRNA expression was significantly increased in invasive pituitary adenomas compared with noninvasive pituitary adenomas (t=2.43, P<0.05). Immunohistochemistry proved OPN expression was located in cytoplasm. Integrated optical density (IOD) of OPN in invasive and noninvasive pituitary adenomas was significantly different (scaled 55.21±12.07 and 48.83±13.78, respectively) (t=3.44, P<0.05). Conclusion OPN and OPN mRNA expressions are enhanced in invasive pituitary adenomas, suggesting OPN functions in the progression of invasive pituitary adenomas. Key words: pituitary neoplasms; osteopontin; neoplasm invasiveness 骨桥蛋白 （Osteopontin，OPN） 是一种磷酸化的分泌蛋白。近年研究表明，OPN与多种肿瘤的浸润、转移及瘤体大小等有关，是一种新的肿瘤标志物[1]。关于OPN在垂体腺瘤侵袭性生长过程中作用的研究报告很少。本研究通过检测OPN在垂体腺瘤中的表达，探讨OPN表达情况与垂体腺瘤侵袭性之间的关系，现报告如下。1 材料与方法 1.1 标本收集 2004年3月~2005年11月，共收集垂体腺瘤标本78例，均来自首次接受手术治疗的病人，术前、术中均未进行化学药物治疗和放射治疗。其中男34例，女44例。年龄17~76岁，平均42.8岁。病程10 d~120个月，平均25.69个月。头痛12例，视力、视野改变22例，内分泌紊乱44例。按分泌激素类型分类：泌乳素 （PRL） 腺瘤 24例，无功能腺瘤21例，生长激素 （GH） 腺瘤17例，促肾上腺皮质激素 （ACTH） 腺瘤9例，PRL+GH腺瘤7例。结合术中所见及影像学检查，凡术中发现肿瘤浸润破坏鞍区硬膜 （包括鞍膈、鞍底、海绵窦）、视神经、动眼神经、蝶窦筛窦骨质等均视为侵袭性垂体腺瘤，本组37例；其余41例为非侵袭性垂体腺瘤。 1.2 材料 1.2.1 主要试剂： 总RNA提取试剂 （美国Gibco BRL公司），低熔点琼脂糖、RT-PCR试剂盒 （美国MBI公司），DNA分子量 （50kb ladder），引物和探针 （上海生工生物工程公司），Taq酶，dNTP，焦碳酸二乙脂 （DEPC），100 bp DNA Ladder Marker，TE缓冲液， 鼠抗人OPN单克隆抗体 （北京中杉金桥公司），S-P9000免疫组织化学染色试剂盒DAB显色剂 （AR1022）。 1.2.2 主要仪器： FTC2000实时荧光定量基因扩增仪，PTC-2000 PCR合成仪，HB2460超净工作台，超低温冰箱 （－80 ℃），电泳仪：Power PAC 1000，凝胶图像分析系统：GDS 8000型。Leica-1512型超薄切片机 LASERPIX图像定量系统。 1.2.3 引物的设计合成： 根据NCBI gene bank中OPN （nm：000582；gi：38146097），GAPDH （nm：0020046， gi：7669491） 序列，由上海生工公司合成、纯化并质量检测。OPN （155bp）：AGTTCTGAGGAAAAGCAGCTTACAACAAATACCCAGATGCTGTGGCCACATGGCTAAACCCTGACCCATCTCAGAAGCAGAATCTC CTAGCCCCACAGAATGCTGTGTCCTCTGAAGAA ACCAATGACTTTAAACAAGACCCTTCCAAGTAA。GAPDH （141bp）：CCTCAAGATCATCAGCAATGCC TCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACCCCTGCCAA GGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGA CTCATGACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCC AGAAGACTGTGGATGG。 1.3 方法 1.3.1 实时荧光PCR测定OPN mRNA： Trizol法提取组织总RNA，进行组织总RNA的鉴定。采用MBI公司的one-step RT-PCR kit，在PTC-2000 PCR仪上进行扩增合成cDNA第1链；从1 μl总cDNA样品中各取3 μl，常规PCR扩增；取反应产物8 μl行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增目的基因的cDNA片断质量；实时荧光定量PCR扩增目的基因 （扩增条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，53 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，45个循环）。45个循环后，根据系统采集到的每一循环反应时各反应管的荧光强度增长指数进行分析，绘制每一反应管的扩增动力学曲线，再根据动力学曲线确定每一反应管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数 （Ct值），得出待测样品的相对拷贝数。 1.3.2 免疫组织化学技术检测OPN的表达： 石蜡切片层厚为5 μm，脱蜡，脱水；3% H2O2室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；微波抗原修复10 min；5%～10%试剂正常山羊血清工作液，室温孵育10 min；滴加OPN抗体 （工作浓度1∶100），4 ℃过夜；滴加试剂生物素化二抗工作液，37 ℃孵育30 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育30 min；DAB显色剂显色5～10 min，显微镜下控制反应；苏木精复染；透明，封片。所有切片在LASERPIX图像定量系统，200倍镜下观察，随机选取5个视野，应用image pro plaus程序，对OPN的表达进行半定量分析，记录积分光密度 （IOD） 值。 1.4 统计学分析 OPN mRNA的相对拷贝数和骨桥蛋白IOD值以均数 ± 标准差 （x ± s） 表示。采用SPSS 10.0统计软件。行t检验，以α = 0.05为检验水准，以P ＜0.05为差异具有统计学意义。2 结 果 2.1 垂体腺瘤OPN mRNA表达 （表1） 2.2 免疫组织化学方法检测OPN的表达 OPN在肿瘤细胞主要表达于细胞质，呈弥漫颗粒。在非侵袭性和侵袭性腺瘤中均有表达，但在侵袭性垂体腺瘤中，OPN为广泛的细胞染色，且着色深 （图 1A）；而在非侵袭性垂体腺瘤中，OPN表达为散在的细胞着色，阳性细胞比例低 （图1B）。OPN蛋白IOD值定量检测侵袭性腺瘤为 （55.21 ± 12.07），非侵袭性腺瘤为 （48.83 ± 13.78），两者的差异具有统计学意义 （t = 3.44，P ＜0.05）。3 讨 论 OPN是Senger于1979年首先发现的一种磷酸化蛋白，在人体正常组织中低表达。近年的研究认为，OPN与许多肿瘤的发生和发展有关。OPN与肿瘤细胞表面受体αVβ整合素和CD44结合，介导细胞-基质间相互作用和细胞间信号传导，提高细胞黏附、化学趋化、侵袭和迁移作用，阻止肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤细胞生存。Coppola等[2]采用免疫组织化学方法证实：胃癌、结肠癌、肾盂细胞癌、食管癌、胰腺癌、肾细胞癌、肺癌和子宫内膜癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌等OPN蛋白表达阳性。研究表明，在癌细胞中OPN mRNA与OPN蛋白高表达，与肿瘤的恶性程度、侵袭能力、转移及预后明显相关，被认为是一种新的肿瘤标志物[3-7]。 垂体腺瘤是颅内常见的肿瘤，组织病理学属良性肿瘤。但部分侵袭性垂体腺瘤常浸润硬膜，侵犯海绵窦、视神经、动眼神经、颅底骨质，在生物形态学上具有恶性行为，但此类垂体腺瘤的侵袭过程和机制尚不清楚。本研究应用实时荧光PCR技术测定侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤OPN mRNA的表达情况，结果显示：在非侵袭性垂体腺瘤中，OPN mRNA的表达是正常垂体组织的5.35倍；而在侵袭性垂体腺瘤中，OPN mRNA的表达是正常垂体组织的9.98倍，两组之间的差异具有统计学意义。免疫组织化学染色结果表明：在垂体腺瘤中OPN蛋白表达定位于肿瘤细胞质，两组之间存在差异；非侵袭性垂体腺瘤中OPN阳性细胞比例低、染色淡，侵袭性垂体腺瘤OPN阳性细胞比例高、染色深，提示侵袭性垂体腺瘤OPN蛋白表达明显增强。以上两方面结果说明：在mRNA和蛋白方面，侵袭性垂体腺瘤OPN的表达水平均显著高于非侵袭性垂体腺瘤，与文献报告一致，提示OPN的高表达可能与肿瘤的侵袭性相关，有望成为侵袭性垂体腺瘤的生物学标志。 OPN参与肿瘤侵袭的机制，目前尚未完全清楚。有学者认为，OPN可以通过VEGF介导和调控内皮细胞的迁移，促进血管的生成[8]。Tuck等[3]认为，OPN不仅通过特殊的细胞表面整合素受体结合生长因子及其受体介导乳腺癌细胞的转移，同时还增加蛋白水解酶的活性 （如u-PA）。Knappe等[9]、Liu等[10]研究认为金属蛋白酶及丝氨酸蛋白酶u-PA等在垂体腺瘤侵袭过程中发挥了作用。本研究的结果表明：在侵袭性垂体腺瘤中，OPN表达增强，提示OPN可能通过u-PA及VEGF等途径促进垂体腺瘤发生侵袭。至于在非侵袭性垂体腺瘤中，OPN也有少量表达，其作用可能是参与肿瘤增殖。Jain等[11]研究认为，OPN抗体可以抑制肝癌细胞的侵袭能力，可以作为治疗肿瘤的一个新靶点。 应用OPN抗体抑制垂体腺瘤侵袭性生长，为治疗侵袭性垂体腺瘤提供了新的思路和手段，作为一个崭新的课题，有待进一步探索。【参考文献】[1] AGRAWAL D, CHEN T, IRBY R, et al. 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