大鼠皮层神经元原代培养、鉴定及氧糖剥夺模型的建立

　　作者：莽靖 李昕华 阎世军 何金婷 邢影 邵延坤 徐忠信 作者单位：吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林 长春 130033

　　【摘要】 目的 原代培养和鉴定大鼠皮层神经元，并建立大鼠皮层神经元氧糖剥夺(OGD)模型。方法 采用酶消化法和机械分离法相结合进行大鼠神经元原代培养，采用抗NSE免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧DHank液及缺氧培养罐行OGD，台盼蓝染色及LDH漏出率检测细胞损伤程度。 结果 神经元培养至第6天，NSE染色阳性细胞为86.32%±2.64%;神经元经不同时长的OGD处理后，台盼蓝染色呈现不同形态;OGD 60 min时，神经元LDH漏出率较对照组明显增加(P<0.05)。结论 成功完成大鼠皮质神经元原代培养，神经元在培养第6天可用于模型制备，成功建立神经元OGD模型。

　　【关键词】 神经元;原代培养;氧糖剥夺

　　体外细胞培养是神经科学研究重要的方法。中枢神经系统对缺血缺氧极其敏感，缺血缺氧性脑损伤是缺血性脑血管病的基础病理过程〔1～3〕。本实验采用大鼠皮层神经元原代培养，应用体外氧糖剥夺(oxygenglucose deprivation，OGD)建立大鼠脑皮层神经元缺血缺氧损伤模型，模拟体内脑缺血过程，对进一步探讨缺血缺氧过程中神经元的病理及病理生理变化，研究其脑损伤的机制，探索新的治疗靶点具有重要意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 大鼠皮层神经元原代培养

　　出生12 h内的Wistar乳鼠，用于皮层神经元原代培养。购自吉林大学动物实验中心。采用酶消化法和机械分离法相结合培养神经元。分离出Wistar鼠皮层组织，剪碎后加入0.125%的胰酶，在37℃，5%CO2培养箱消化、震荡，形成细胞悬液后接种培养，6 d后进行鉴定。

　　1.2 大鼠皮层神经元鉴定

　　①细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。②神经元在培养第6天用特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学染色进行鉴定，显微镜下观察，以在细胞膜和胞浆内出现棕黄色颗粒者判定为阳性，每张爬片随机选取3个200倍视野，计数，取均值，计算阳性细胞百分比。

　　1.3 体外培养神经元OGD模型的建立

　　①缺氧DHank液制备。利用自行设计生产的组装瓶将DHank液通入含95%N2及5%CO2的缺氧气体，制备缺氧DHank液，用血气分析仪测定缺氧DHank液的氧浓度。②缺氧罐的制作及应用。将真空干燥器通入缺氧气体制成缺氧罐，用麻醉气体分析仪测定缺氧罐内氧含量。③神经细胞OGD模型的建立。将培养第6天的神经元用缺氧DHank液孵育，并放入缺氧罐中，将缺氧罐放入37℃孵箱内开始计时;分别取缺氧时间为15、30、45、60、90、120、180 min再复氧24 h的神经元进行评价。

　　1.4 体外培养神经元OGD模型的评价

　　①台盼蓝染色法测定细胞死亡率。测定时取出培养板，每个时间点取3孔，吸弃上清液，然后加一滴 0.4%台盼蓝溶液，在3 min内随机计数200个细胞中蓝染的死细胞及未蓝染活细胞的细胞数，计算细胞死亡率。②LDH漏出率的检测。将待测细胞培养板取出，每组每个时间点取3孔，吸取各孔内的培养液入相应试管内，加入等量PBS 液，制备成细胞匀浆液，收集入相应的试管内。每孔液体设2个试管，分别测定细胞培养液和细胞匀浆液的OD值。按公式计算LDH漏出率。

　　1.5 统计学处理

　　数据以x±s表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 大鼠皮层神经元原代培养及鉴定

　　神经元在培养第6天分化成熟，可见细胞散在生长，胞体小，折光性强，形成密集的神经细胞网络。培养第6天，可见大部分细胞染成棕黄色，NSE阳性细胞占全部细胞的百分比的86.32%±2.64%，见图1。

　　2.2 缺氧DHank液体氧浓度及缺氧罐氧含量

　　缺氧DHank液体的氧浓度低于1%，缺氧罐内氧含量为1%±0.1%，二氧化碳浓度为5%±0.1%。

　　2.3 神经元不同OGD时间细胞死亡率

　　神经元OGD 15、30 min，所有细胞均未受损伤;45、60 min少部分神经元蓝染，细胞死亡率为15.00%±2.50%、22.17%±1.04%;90、120 min使神经元出现皱缩，胞浆空泡明显，突起缩短、断裂，胞浆空泡明显，蓝染细胞增多，细胞死亡率为40.67%±2.08%、56.00%±2.17%;180 min使神经元轮廓模糊，全部蓝染，细胞死亡率为97.17%±1.89%。

　　2.4 LDH漏出率检测

　　随OGD时间增加，神经元LDH漏出率逐渐增加，其中神经元OGD 45 min时LDH漏出率开始明显增加(P<0.05)。见图2。

　　3 讨论

　　体外细胞培养已被广泛应用于神经细胞分子生物学研究。本研究采用酶消化法和机械分离法相结合成功进行体外神经元原代培养并通过NSE免疫细胞化学染色进行鉴定。NSE是一种酸性可溶性蛋白质，是神经细胞分化程度特异性标志物，应用NSE特异性抗体经免疫细胞化学染色，光镜下可见神经元胞浆被染成棕黄色，形态为椭圆形、三角形、突起相互交织成网状，随机选取细胞计数后，NSE阳性细胞百分率>85%。提示本实验培养出高纯度及发育成熟的神经元。

　　缺血缺氧性脑损伤模型报道较多〔4,5〕，方法及实际操作不尽相同，但体内实验模型难免受到体液、循环等复杂因素的影响，很难解释某单一因素的影响作用及强度。本实验利用自行设计、长春应用化学研究所生产的组装瓶和负压吸引装置将DHank平衡盐溶液处理成缺氧的细胞培养液，液体的氧浓度<1%，将真空干燥器制成缺氧罐，罐内O2含量<1%，CO2浓度为5%，台盼蓝染色显示OGD 30 min内，神经元未见明显损伤，90 min时神经元出现皱缩，细胞死亡增多，随OGD时间增加，神经元LDH漏出率逐渐增加，其中OGD 0和15 min神经元LDH漏出率无显著差异，OGD 60 min时明显增加。

　　本文表明OGD方法可明显造成神经元损伤，能成功模拟体内脑缺血过程，为研究神经细胞缺血损伤机制的进一步研究可提供有效、简单、实用、可靠的方法和手段。

　　【参考文献】

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