氧合血红蛋白对脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

氧合血红蛋白对脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响作者：李德生    作者单位：100071 北京,军事医学科学院附属307医院神经外科 【摘要】  目的 探讨氧合血红蛋白（OxyHb）对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法 将原代培养的大鼠脑血管内皮细胞与不同浓度的氧合血红蛋白共孵育，以MTT法检测脑血管内皮细胞的存活率；将氧合血红蛋白与脑血管内皮细胞共培养，以流式细胞仪和Hochest33258荧光染色法检测细胞凋亡的情况。结果 氧合血红蛋白能显著抑制血管内皮细胞的增殖，与对照相比存在统计学意义，能显著诱导血管内皮细胞凋亡。结论 在一定浓度范围内的OxyHb能够明显抑制原代培养的脑血管内皮细胞增殖并引起凋亡， 提示SAH后内皮细胞凋亡可能是发生CVS的原因之一。 【关键词】  蛛网膜下腔出血 脑血管痉挛 内皮细胞 凋亡    Effect of oxyhaemoglobin on proliferation and apoptosis of brain vascular endothelial cells in vitro  LI Desheng, QIU Haixia, XU Bainan,et al. Department of Neurosurgery,307 Hospital Affiliated to Military Medical Institute,Beijing 100071,China    Abstract:Objective  To investigate the effect of oxyhaemoglobin (OxyHb) on proliferation and apoptosis of cultured rat brain microvascular endothelial cells(RBMvECs). Methods  Primary cultured RBMvECs were incubated with various concentrations of OxyHb for various times. Cell proliferation ability was assessed by MTT method, cell apoptosis was measured by flow cytometry and Hochest33258 fluorescent stain methods.  Results  OxyHb can significantly inhibit the proliferation and induced apoptosis of RBMvECs compared with control. The RBMvECs apoptotic rate were related to the concentration of OxyHb and cultured time. Conclusions  OxyHb can induced primary cultured RBMvECs apoptosis at certain concentrations which suggests apoptosis of endothelial cells might be one of the causes of CVS after SAH. 　　    Key words:subarachnoid hemorrhage; cerebral vasospasm;endothelial cell; apoptosis  　　    脑血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)是蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)后最严重的并发症之一，常常伴有继发性缺血性脑损害，具有较高的致残率和致死率。SAH后发生CVS的确切机制尚未完全阐明，研究发现脑血管内皮细胞的损伤是SAH后脑动脉病理变化的重要特征［1］，血管内皮细胞的凋亡与CVS的发生密切相关［2］，但其凋亡机制目前尚不完全清楚。本研究探讨了在体外条件下，氧合血红蛋白(oxyhaemoglobin，OxyHb)诱导原代培养的大鼠脑血管内皮细胞的凋亡情况，为进一步了解内皮细胞凋亡在CVS中的可能作用及其机制提供初步的理论依据。1  资料和方法    1.1  实验动物和材料  出生3～5 d的SD乳鼠，体重15～20 g，雌雄不限。MTT，Hoechst33258，人血红蛋白，二甲亚砜，Annexin VFITC/ PI均购自美国Sigma公司；流式细胞仪（FACS Calibur型），美国Becton Dickinson公司；DU600紫外/可见光分光光度计，美国Beckman Coulter公司；Olympus荧光显微镜，日本Olympus公司生产。    1.2  原代大鼠脑皮质血管内皮细胞的培养  采用Domotor［3］方法并略修改后进行脑皮质微血管内皮细胞的分离与培养。    1.3  脑血管内皮细胞的鉴定  取对数生长期传代后的脑血管内皮细胞消化后接种于盖玻片上。当细胞70%～80%融合后，用SABC免疫组织化学方法对原代培养的脑血管内皮细胞进行Ⅷ因子相关抗原鉴定。    1.4  细胞准备和实验分组  将培养的内皮细胞制成单细胞悬液，接种于96孔培养板中培养。分组如下：①空白对照组，②实验组按OxyHb的浓度分为1μmol/L、10μmol/L以及100μmol/L 3个浓度，刺激时间分别为6 h、12 h和24 h，每个实验点均设6个平行样本。    1.5  OxyHb溶液的制备  无菌条件下取人血红蛋白以连二硫酸钠提纯OxyHb， 4℃ 透析18 h去除连二硫酸钠，用紫外分光光度计测定其中OxyHb的浓度，-20℃储存备用，临用前以DMEM稀释至所需浓度［4］。    1.6 MTT检测  将血管内皮细胞与OxyHb分别孵育6 h、12 h和24 h后，更换无血清培养基继续培养20 h，加入MTT（5 mg/ml），每孔20 μL，继续培养4 h后小心弃掉培养液，每孔再加入150 μL二甲亚砜（Dimethylsul foxide，DMSO），微型振荡器振荡10 min，应用318MC酶标仪检测570 nm处各孔的OD值。以实验平行的单纯培养液的空白孔调零，记录OD值，每个实验重复3次，每次取其平均值，按如下公式计算细胞的存活率。    细胞的存活率=（实验组OD值本底OD值）/（空白组OD组本底OD值）×100%。    1.7  血管内皮细胞凋亡的检测    1.7.1  Hoschest 33258荧光染色  OxyHb刺激浓度为10 μmol/L和100 μmol/L，在分别培养6 h、12 h和24 h后，以不含胎牛血清的培养基洗涤两次，加入Hoechst33258 1 ml(2μg/ml)，避光染色10 min，PBS清洗两次，荧光显微镜下观察拍照。    1.7.2  流式细胞仪检测  在培养瓶中进行细胞培养，至细胞75%～80%融合时与浓度为10 μmol/L或100 μmol/L OxyHb分别培养6 h、12 h和24 h，以不含胎牛血清的培养基洗涤两次，在OxyHb刺激后的相应时间，分别用细胞刮刀刮取内皮细胞并收集，PBS离心洗涤1次，加入5 μl Annexin VFITC和10 μl PI，混匀后室温下避光孵育15 min，立即行流式细胞仪（Flow cytometry，FCM）检测，应用Cellquest软件进行分析。    1.8  统计学分析  应用SPSS 10.0软件包进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本的t检验进行统计。2  结  果    2.1  原代培养的脑血管内皮细胞的鉴定  培养4～5 d后可观察到血管片段内有伪足伸出，细胞开始分裂增殖，一周左右时可见细胞分裂成多个片状单层细胞，形态不一，以长梭形为主。进一步传代后得到形态较为均匀一致的脑血管内皮细胞。SABC免疫组化检测Ⅷ因子相关抗原情况：细胞着色强度高于背景染色者判定为阳性，Ⅷ因子相关抗原抗体表达部位为胞浆，表现为胞浆棕黄色颗粒。阳性细胞计数发现内皮细胞的纯度均在95% 以上（图1）。    图1  Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定血管内皮细胞（×200）  a:Ⅷ因子阳性染色的血管内皮细胞b:阴性对照    2.2  内皮细胞的MTT检测结果   除1 μmol/L OxyHb刺激6 h时，血管内皮细胞的存活率与对照组相比无显著差异外（P>0.05），其余各浓度及作用时间条件下，OxyHb均能显著抑制血管内皮细胞生长（P<0.01），且其抑制效应随孵育浓度和孵育时间的增加而增强（表1）。表1  OxyHb孵育浓度及时间对大鼠脑微血管与对照组比较* P<0.01    2.3  内皮细胞凋亡检测结果    2.3.1  Hoschest 33258染色结果  正常对照组内皮细胞经Hoschest 33258染色后，荧光显微镜下可见内皮细胞核边缘光滑、完整而且密度均一，核内染色质均匀淡染。经不同浓度的OxyHb刺激后可见部分细胞的核膜皱缩、核染色质致密伴荧光染色增强，部分细胞内可见细胞核碎裂及凋亡小体形成，刺激浓度越大、时间越长出现这种变化越明显，细胞也越多，见图2。    图2  OxyHb刺激内皮细胞后Hoechst33258荧光染色  a:正常内皮细胞, 细胞核淡染(×100)    ;b:100μmol/L OxyHb刺激24 h(×100)  ;c:放大后的荧光染色图片(×100)显示典型的细胞核碎裂、凋亡小体形成  表2   OxyHb孵育浓度和孵育时间对 与对照组比较#P<0.05，*P<0.01    2.3.2  流式检测结果  表2为经不同浓度血管OxyHb刺激后，AnnexinV/PI双染内皮细胞的凋亡情况。无论是10 μmol/L还是100 μmol/L的OxyHb均能显著诱导内皮细胞凋亡，与对照组存在显著差异，并呈浓度依赖性（P<0.05或P< 0.01），图3为一次典型的流式结果图。3  讨  论    SAH后红细胞溶解释放的OxyHb是引起脑血管痉挛的关键因素［5,6］。近年来SAH后脑血管内皮细胞的功能变化及凋亡在CVS中的作用也已成为研究的热点［7,8］。因此本文观察了应用OxyHb诱导原代培养的大鼠脑血管内皮细胞的凋亡情况，进一步探讨其在CVS中所起的作用。    Pluta等［9］发现在SAH后7 d，蛛网膜下腔凝血块中OxyHb和脱氧血红蛋白的浓度大约为70 umol/L。然而，尽管存在于脑血管表面的OxyHb浓度很高，但实际上透过血管并与血管内皮细胞接触的OxyHb的浓度却低于该水平。所以本实验选取了1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L三个浓度的OxyHb进行实验。结果发现，除OxyHb 1 μmol/L作用6小时组与对照相比无显著性差异外，其余各浓度及各作用时间条件下，OxyHb均能显著抑制血管内皮细胞的生长（P<0.01），且其抑制效应随孵育浓度和时间的增加而增强。在此基础上还进一步观察了OxyHb诱导内皮细胞死亡的方式。在经不同浓度的OxyHb刺激后，应用荧光显微镜可见经Hoschest 33258荧光染色后内皮细胞荧光染色逐渐增强，部分细胞内可见细胞核碎裂及凋亡小体形成，随刺激浓度越大、时间越长这种变化越明显，细胞也越多。另外，流式检测结果也提示，在OxyHb刺激后，早期就可出现内皮细胞的凋亡，而且随着刺激浓度和刺激时间的延长，内皮细胞凋亡的比例逐渐增高，并以晚期凋亡为主，其演变规律符合Hoschest 33258荧光染色后的结果趋势，与文献报道结果类似［10］，初步证实凋亡是OxyHb作用后内皮细胞的主要死亡方式。　　关于SAH后OxyHb诱导血管内皮细胞凋亡的机制目前尚不清楚，一种可能的解释是自由基的作用。蛛网膜下腔的OxyHb会经历缓慢和自发的氧化还原反应，在此过程中被氧化还原成超氧化物，这些物质又能启动并生成脂氧化物。已经发现这些自由基在其它组织中是重要的凋亡诱导物质［11,12］；另一种可能的机制是该过程中内皮细胞中钙离子浓度的升高，持续的高钙离子能够刺激产生一种内生性的核酸内切酶同时其活性增高启动细胞凋亡［13］；除此外也有人提出在凝血块中也可能存在其它的导致细胞凋亡的成份［14,15］。    血管内皮凋亡在血管痉挛中的意义何在？目前已知，内皮细胞凋亡会导致血管内皮细胞功能发生变化，导致缩血管和扩血管物质分泌失衡，使得NO和前列腺环素等扩血管物质大大减少，促进血管收缩；另一方面，内皮细胞的凋亡还会导致血管完整性的破坏，从而将血管平滑肌暴露于缩血管物质的作用之下，加剧脑血管痉挛。此外，受损的内皮细胞还可以引发血栓形成，造成血管狭窄，加重脑血管痉挛后的缺血性的脑损伤。综上所述，SAH后脑血管内皮细胞的确存在凋亡，这种凋亡可能是触发血管痉挛的重要原因，对其凋亡机制的进一步研究不仅有助于阐明发病机制，而且对于临床治疗方案的进一步优化也会产生重要影响。【参考文献】［1］Zubkov AY, Tibbs RE, Aoki K, et al. Morphological changes of cerebral penetrating arteries in a canine double hemorrhage model［J］. Surg Neurol, 2000, 54:212．［2］Zubkov AY, Ogihara K, Bernanke DH, et al. Apoptosis of endothelial cells in vessels affected by cerebral vasospasm［J］. Surg Neurol,2000, 53:260．［3］Domotor E, Sipos I, Kittel A, et al. Improved growth of cultured brain microvascular endothelial cells on glass coated with a biological matrix［J］. Neurochem Int, 1998, 33: 473．［4］Meguro T, Chen B, Parent AD,et al. Caspase inhibitors attenuate oxyhemoglobininduced apoptosis in endothelial cells［J］. Stroke, 2001, 32:561．［5］ Zubkov AY, Ogihara K, Tumu P, et al. Bloody cerebralspinal fluid alters contractility of cultured arteries［J］. Neurol Res, 1999, 21: 553．［6］Zubkov AY, Rollins KS, McGehee B, et al. Relaxant effect of U0126 in hemolysate, oxyhemoglobin, and bloody cerebrospinal fluid induced contraction in rabbit basilar artery［J］. Stroke, 2001, 32:154．［7］Frijns CJ, Kasius KM, Algra A, et al. Endothelial cell activation markers and delayed cerebral ischaemia in patients with subarachnoid haemorrhage［J］. J Neurol Neurosurg Psychiatry,2006, 77: 863．［8］Sen O, Caner H, Aydin MV, et al. The effect of mexiletine on the level of lipid peroxidation and apoptosis of endothelium following experimental subarachnoid hemorrhage［J］. Neurol Res, 2006, 28:859.［9］ Pluta RM, Afshar JK, Boock RJ, et al. Temporal changes in perivascular concentrations of oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, and methemoglobin after subarachnoid hemorrhage［J］. J Neurosurg, 1998, 88:557．［10］Ogihara K, Zubkov AY, Bernanke DH, et al. Oxyhemoglobininduced apoptosis in cultured endothelial cells［J］. J Neurosurg, 1999, 91:459．［11］Li PF, Dietz R, von Harsdorf R. Differential effect of hydrogen peroxide and superoxide anion on apoptosis and proliferation of vascular smooth muscle cells［J］. Circulation, 1997, 96: 3602．［12］Wolfe JT, Ross D, Cohen GM. A role for metals and free radicals in the induction of apoptosis in thymocytes［J］. FEBS Lett, 1994, 352: 58．

［13］Marks AR. Intracellular calciumrelease channels: regulators of cell life and death［J］. Am J Physiol, 1997, 272: 597．［14］Dawicki DD, Chatterjee D, Wyche J, et al. Extracellular ATP and adenosine cause apoptosis of pulmonary artery endothelial cells［J］. Am J Physiol, 1997, 273:485．［15］Tsukada T, Eguchi K, Migita K, et al. Transforming growth factor beta 1 induces apoptotic cell death in cultured human umbilical vein endothelial cells with downregualted expression of bcl2［J］. Biochem Biophy Res Commun, 1995, 210:1076．