高频电刺激丘脑底核对黑质神经元保护作用的研究

作者：马羽， 王忠诚， 张建国， 张 凯， 刘焕光， 杨岸超    作者单位：1. 北京市神经外科研究所功能神经外科研究室； 2. 首都医科大学附属北京天坛医院神经外科， 北京 100050

【摘要】 目的 探讨高频电刺激丘脑底核对帕金森病 （PD） 大鼠黑质致密部 （SNc） 神经元的保护作用及机制。 方法 将40只SD大鼠随机分为3组，正常对照组10只，模型组及刺激组各15只。模型组及刺激组大鼠于脑内侧前脑束注射6-羟基多巴胺 （6-OHDA） 制备大鼠偏侧PD模型，刺激组大鼠丘脑底核区植入刺激电极实施高频电刺激 （130 Hz），对三组动物的行为学、SNc神经元的形态学改变进行观察和分析。 结果 术后2、4周时，刺激组SNc神经元凋亡的阳性率分别为 （39.98 ± 12.11）%和 （41.12 ± 9.23）%，模型组则为 （61.74 ± 7.82）%和 （67.12 ± 10.23）%；两组比较，差异有统计学意义 （P ＜0.05）。术后2、4周时，刺激组Bcl-2/Bax比值为0.84 ± 1.01和0.88 ± 0.81，模型组则为0.39 ± 0.15和0.30 ± 0.58；两组比较，差异有统计学意义 （P ＜0.05）。 结论 高频刺激丘脑底核对PD大鼠黑质SNc神经元有保护作用，其机制可能与改变了SNc区神经递质的分布和代谢有关。

【关键词】  帕金森病 细胞凋亡 高频电刺激

　　Neuroprotective effects of high frequency stimulation of the subthalamic nucleus on the substantia nigra neurons

　　MA Yu1, WANG Zhongcheng1, ZHANG Jianguo2,  et al.

　　1. Functional Neurosurgery Lab, Beijing Neurosurgical Institute; 2. Department of Neurosurgery, Tiantan Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

　　Abstract:  Objective  To investigate the neuroprotective effects of high frequency stimulation of the subthalamic nucleus (HFS-STN) on the substantia nigra pars compacta (SNc) neurons.  Methods  Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: control group with 10, model group with 15 and stimulation group with 15. To establish the rat models for Parkinson disease (PD), 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was unilaterally microinjected into the right medial forebrain bundle (MFB) of rats in model group and stimulation group. The behavior change and the morphologic abnormality of SNc dopaminergic neurons of the PD rats were observed and analyzed in the 3 groups.  Results  The apoptosis rate of SNc neurons was 39.98±12.11% and 41.12±9.23% at weeks 2 and 4 after the operation in the stimulation group, and 61.74±7.82% and 67.12±10.23% in model group respectively, with statistical differences between two groups (P<0.05). At 2 weeks, Bcl-2/Bax was 0.39±0.15 in model group and 0.84±1.01 in stimulation group and at 4 weeks it was 0.30±0.58 and 0.88±0.81 respectively,  with statistical differences between two groups.  Conclusion  HFS-STN has protective effects on SNc neurons of PD rats, which may be due to the changes of the distribution and metabolism of neurotransmitters in SNc.

　　Key words:  Parkinson disease;  apoptosis;  high frequency stimulation

　　帕金森病 （PD） 的确切发病机制及神经元缺失的原因至今未明，相关研究发现，细胞凋亡在PD发生、发展中起着重要的作用[1-2]。Rodriguez等[3]认为：抑制STN核团异常活动可作为PD病人的神经保护措施。Temel等[4]证实电刺激双侧丘脑底核能够减少6-羟基多巴胺 （6-OHDA） 诱导大鼠黑质区神经元缺失的数量，增加酪胺酸羟化酶 （TH） 的表达，具有神经元保护作用。本研究通过观察高频电刺激丘脑底核 （HFS-STN） 对PD大鼠黑质致命部 （SNc） 神经元凋亡情况的影响，探讨其保护作用及机制。

　　1    材料与方法

　　1.1    实验动物与分组    成年雄性SD大鼠40只，体质量 （250 ± 30） g，购自北京市神经外科研究所动物实验室。随机分为正常对照组大鼠10只，模型组及刺激组各15只。

　　1.2    大鼠PD模型的建立    颅脑平位固定在脑立体仪上 （美国STEOELTING公司），按Paxinos-Watson的大鼠脑定位图谱，确定右侧内侧前脑束 （MFB） 两点坐标：①前囟后：3.5 mm；中线右侧：0.5 mm；硬膜下：9 mm。②前囟后：4.4 mm；中线右侧：1.5 mm；硬膜下：7.8 mm。采用10 μl微量注射器由自动进样仪 （美国STEOELTING公司） 推动，向两点分别注入6-OHDA （美国sigma公司） 2.5 μl、3.0 μl，制作PD模型。

　　1.3    安装刺激电极    制模当天，刺激组大鼠于右侧STN坐标处植入刺激电极；自术后第1天始至处死前，每24 h电刺激STN，持续刺激60 min，强度2 V，波宽0.12 ms，频率130 Hz，间停10 min，循环刺激2次。

　　1.4    行为学观察    术后第3天开始，每天各组大鼠均于颈部皮下注射阿扑吗啡 （APO，美国sigma公司） 0.5 mg/kg （0.5g/L），观察诱发出大鼠健侧旋转行为的出现时间，及2周、4周时大鼠的旋转情况。注射APO 10 min后开始记录旋转频率，共记录30 min。3次测试结果＞7圈/min视为成功的PD模型。

　　1.5    病理学观察    各组大鼠分别于2周、4周时断头取脑，常规灌流固定，进行石蜡包埋，连续冠状切片并编号，行Nissl染色、TUNEL （试剂盒，南京建成公司） 及Bcl-2蛋白、Bax蛋白免疫组织化学检测 （试剂盒，武汉博士德公司），光镜下观察脑组织形态。采用CIAS1000彩色病理图文分析系统 （日本LEICA公司） 对切片进行图像分析，高倍镜下，每张切片于SNc区随机取3个视野，测量灰度值，取平均值。

　　1.6    数据处理    所有数据以x ± s表示，采用t检验和单因素方差分析F检验，数据处理均应用SPSS 11.0软件包完成，P ＜0.05为有统计学意义。

　　2    结    果

　　2.1    行为学检测结果    建模后，模型组及刺激组大鼠的旋转频率随时间延长逐渐增加，模型组成功13只，刺激组成功12只。模型组诱导的旋转行为出现最早，平均 （6.4 ± 0.84） d；且同时期旋转频率最快，2周、4周时分别为 （13.45 ± 2.07） 圈/min、（12.13 ± 4.54） 圈/min。刺激组平均 （7.67 ± 1.37） d出现旋转行为；1周时，刺激组与模型组之间差异无统计学意义 （P ＞0.05）；2周、4周时，两组差异有统计学意义 （P ＜0.05），分别为 （10.50 ± 0.58） 圈/min、（9.11 ± 1.92） 圈/min。

　　2.2    Nissl染色，TUNEL及Bcl-2、Bax检测 （表1）

　　与对照组相比，刺激组和模型组大鼠6-OHDA注药侧SNc区神经元数量明显减少，尼氏体模糊，颗粒密度降低 （图1），图像平均灰度值差异有统计学意义 （P ＜0.05）。术后2、4周时，刺激组与模型组大鼠于注药侧SNc区均检测出TUNEL阳性细胞 （图2），差异有统计学意义 （P ＜0.05）。与模型组相比，刺激组大鼠SNc区Bcl-2表达上调、Bax的表达下调，Bcl-2/Bax比值增大，且造模后4周时差异比2周时更为明显 （P ＜0.05）。

　　3    讨    论

　　神经元仅能生长而不能分裂增殖，这一特性决定了保护残存神经元、挽救受损神经元具有重要意义。形态学研究表明：PD病人脑内多巴胺 （DA） 能神经元死亡方式呈凋亡样改变[2]，而中脑黑质区残存DA能神经元凋亡的过度发生是其继发性损伤机制之一。本实验选择MFB为注药靶点，通过破坏黑质－纹状体通路间的神经纤维，引起黑质DA能神经元逆行性变性，旨在观察6-OHDA的快速致凋亡作用，结果损伤的速度较快，且神经元凋亡率稍高[5]。本实验刺激组大鼠病侧SNc的凋亡神经元阳性率明显低于模型组，说明高频电刺激对SNc神经元具有一定的保护作用；该结果支持抑制STN异常兴奋性能够延缓SNc神经元缺失速度的假设[3]。

　　细胞凋亡是一种受基因调控特殊类型的细胞死亡方式，通过合成某些新的蛋白质来实现。这些蛋白质主要包括抗凋亡蛋白 （Bcl-2及Bcl-XL等） 和促凋亡蛋白 （Bax、Bcl-XS及Bad等）。Bcl-2和Bax分别是这两类蛋白的代表，其中Bax是促凋亡因子，而Bcl-2则是抗凋亡蛋白；Bcl-2及Bax的表达量及比值变化可调节细胞死亡与存活之间的平衡，决定着凋亡的发生，与凋亡发展阶段密切相关[6]。因此，测定Bcl-2/Bax的比值有助于判断是否会发生凋亡。本实验结果虽然没有显示出刺激组的Bcl-2表达呈强阳性，但Bcl-2/Bax比值较高，提示高频电刺激能够诱导有保护作用的Bcl-2等因子的基因表达。Temel等[4]的研究也显示：接受双侧HFS-STN的 PD大鼠SNc神经元数量及TH表达均高于同期未接受电刺激的PD大鼠；作者认为HFS-STN 增强了残存DA神经元的功能，延缓了DA神经元死亡的速度。

　　本研究中，我们还观察到刺激组大鼠异常行为出现的时间均晚于模型组，刺激STN后，其易激惹、尾僵直、行走缓慢等异常行为得到明显改善。与此相似，临床上也发现接受STN深部电刺激 （DBS） 治疗的PD病人术后4年时，运动症状较术前进展缓慢，明显好于未手术者[7]。

　　在许多退行性神经系统疾病 （如Huntington病和Alzheimer病） 的发病机制中，谷氨酸 （Glu） 介导的兴奋毒作用可能是造成神经元死亡的最后通路[8-9]。近年来，对PD有关兴奋性氨基酸 （EAA） 的研究证实：Glu的神经毒作用可选择性引起黑质DA能神经元损伤。依据经典的基底核环路理论，STN发出大量的Glu能兴奋性神经纤维投射至SNc的DA能神经元，发生PD时STN活动增强，在SNc区释放大量的Glu，并通过Glu引起了SNc 残存DA能神经元的继发性伤害。动物实验发现：Glu受体拮抗剂的应用能够有效保护黑质DA能神经元，缓解PD症状。推测高频电刺激STN通过抑制其异常活动，可阻断Glu介导的神经毒作用，减少神经元凋亡的发生，保护DA能神经元。本实验刺激组2周内，每天仅给予高频电刺激2 h已表现出其对神经元的保护作用，而临床上采用慢性持续刺激治疗PD，因此，对持续刺激STN引起的SNc神经元保护作用仍需一步探索。

【参考文献】[1] 黄觉斌. 帕金森病的危险因素及其预防 [J]. 现代康复, 2000, 4(2): 163-165.

[2] 梁天佳, 莫雪安. 帕金森病发病机制研究进展 [J]. 医学综述, 2008, 14(7): 1040-1042.

[3] RODRIGUEZ M C, OBESO J A, OLANOW C W. Subtha- lamic nucleus-mediated excitotoxicity in Parkinson's disease: a target for neuroprotection [J]. Ann Neurol, 1998, 44(3 Suppl 1): 175-188.

[4] TEMEL Y, VISSER-VANDEWALLE V, KAPLAN S, et al. Protection of nigral cell death by bilateral subthalamic nu- cleus stimulation [J]. Brain Res, 2006, 1120(1): 100-1005.

[5] HE Y, LEE T, LEONG S K. 6-Hydroxydopamine induced apoptosis of dopaminergic cells in the rat substantia nigra [J]. Brain Res, 2000, 858(1): 163-166.

[6] SHINOURA N, SATOU R, YOSHIDA Y, et al. A denovirus- mediated transfer of bcl-X (L) protects neuronal cells from bax-induced apoptosis [J]. Exp Cell Res, 2000, 254(2): 221- 231.

[7] 杨晨, 江澄川. 脑深部刺激治疗帕金森病的疗效回顾 [J]. 中华神经外科杂志, 2006, 22(5): 319-321.

[8] SAVITZ S I, ROSENBAUM D M. Apoptosis in neurologi- cal diseases [J]. Neurosurgery, 1998, 42(3): 555-572.

[9] 王建枝, 刘世杰. 神经退行性疾病神经细胞死亡机理 [J]. 国外医学: 分子生物学分册, 2003, 25(1): 41-44.