SD大鼠动眼神经不同部位损伤后对靶器官特异性支配的实验研究

    作者：李心远    作者单位：上海交通大学医学院附属新华医院神经外科， 上海 200092

    【摘要】  目的 研究不同部位损伤对Sprague-Dawley （SD） 大鼠动眼神经功能修复的影响及可能机制。 方法 实验Ⅰ组大鼠 （n = 24） 经幕下、实验Ⅱ组 （n = 24） 大鼠经眶上裂干预动眼神经，术后通过前庭眼反射评估眼外肌在垂直、水平方向的恢复程度。经右侧上直肌注射辣根过氧化酶 （HRP），逆行追踪中脑动眼神经核团内神经元分布；48 h后行动眼神经组织学、解剖学研究。 结果 实验Ⅰ组大鼠支配上直肌的神经纤维有45%~51%由对侧中脑运动神经元发出；实验Ⅱ组81%~87%由对侧中脑运动神经元发出，神经元在中脑的分布更接近正常大鼠。实验Ⅱ组大鼠眼外肌功能恢复程度明显优于实验Ⅰ组大鼠。 结论 动眼神经损伤部位距离眼外肌越近，最终的神经功能恢复水平越好，这可能与再生神经纤维通过损伤部位时的迷行程度相关。

    【关键词】  动眼神经 脑神经损伤 修复外科手术 神经再生

    Specific target organ innervating of the oculomotor nerve with different site injuries in SD rats:

    experiment study

    LI Xinyuan, LI Shiting, ZHONG Jun, et al.

    Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200092, China

    Abstract：  Objective  To investigate the effect of different site injury to the oculomotor nerve on functional recovery and its probable mechanism in SD rats.  Methods  The third cranial nerve was dissected and repaired at the subtentorial area (group Ⅰ, n = 24) and the supraorbital fissure (group Ⅱ, n = 24), the functional recovery was evaluated by measuring the horizontal and vertical vestibule-ocular reflexes. HRP was injected to the superior rectus muscle to retrogradely label the neuron distribution in the oculomotor nucleus. The anatomy and histology of the oculomotor nerve were studied 48 h after the injection.  Results  45-51% of the nerve fibers innervating the superior rectus muscle in rats of group Ⅰ and 81-87%  in group Ⅱ came from the neuron in contralateral midbrain, and the distribution of the neurons in midbrain was closer to normal rats in group Ⅱ than group Ⅰ. The degree of functional recovery of extraocular muscle was also significantly better in group Ⅱ than group Ⅰ.  Conclusion  The closer the injury site is to the target organ, the better the functional recovery, which may be related to the aberrant degree of the regenerated nerve fibers running in the injury fragment of the nerve.

    Key words：  oculomotor nerve;  cranial nerve injuries;  reconstructive surgical procedures;  recovery of function;  nerve regeneration

    文献报告[1-5]及我们的研究均发现：大鼠动眼神经损伤后，其副交感神经功能恢复较好，而其支配的眼外肌躯体运动功能恢复较差，且可能出现异常的眼外肌活动。有学者提出这是由于修复方式不同所致，也有学者[1，4，6]认为是再生的神经纤维对靶器官的非特异性支配影响了眼外肌功能的恢复。为此，我们将实验大鼠的动眼神经分别在幕下和眶上裂予以切断和原位对接固定，研究动眼神经损伤后功能修复的可能机制。

    1    材料与方法

    1.1    动物分组和手术方法    成年雄性Sprague-Dawley （SD） 大鼠 （上海BK公司） 60只，体质量250~300 g；使用许可证号：SYXK （沪） 2003-0047。随机分为4组，其中实验Ⅰ组24只，在幕下切断动眼神经，原位端端对齐，生物胶固定；实验Ⅱ组24只，以相同方法在眶上裂干预；损伤对照组6只 （幕下、眶上裂各3只），神经切断后双极电凝断端，并将近端向后翻转；正常对照组6只，神经不损伤。实验组大鼠死亡3只，死亡原因：术中出血2只，术后感染1只。

    1.2    动眼神经躯体运动功能测定    神经损伤后1~24周，每周1次测定前庭眼球反射。将动物乙醚麻醉后置于反射装置上，刺激频率0.02~0.40 Hz，分别在水平轴、垂直轴进行。

    1.3    眼外肌辣根过氧化酶 （HRP） 注射    对照组大鼠于实验后1周，实验组大鼠于1、12、24周，经腹腔内注射安定 （2 mg/100 g），肌肉注射盐酸氯胺酮 （4 mg/100 g） 深度麻醉动物。经右侧眼球结膜入路暴露上直肌，鞘内注射HRP 0.85 μl，逆行标记动眼神经核内的运动神经元。

    1.4    切片、标本制作    HRP注射48 h后麻醉动物，经心脏灌注温生理盐水、1.25%多聚甲醛、2.5%戊二醛、0.1 mol/l磷酸缓冲液固定。在中脑动眼神经核水平和动眼神经损伤点近、远段各5 mm取材，将标本放入30%蔗糖缓冲液浸泡固定后，行50 μm层厚连续冷冻切片，采用Angelov法[7]进行四甲基联苯胺 （TMB） 还原染色。

    1.5    神经解剖学及组织学研究    在光镜、电子显微镜下观察神经元、神经轴突结构，计算神经元、神经轴突数量及神经轴突直径。参照Pallini等方法，应用计算机图像分析系统分析HRP标记的中脑运动神经元分布、神经纤维直径、髓鞘厚度。

    1.6    统计方法    动物切片采用Vidas Rel.2.1型图像分析系统进行统计学处理，数据采用t检验和方差分析。

    2    结    果

    2.1    动眼神经躯体运动功能    术后24周，在频率为0.40 Hz的光刺激下，实验Ⅱ组大鼠在水平方向运动幅度 （HVOR） 平均达到正常的91%，垂直方向运动幅度 （VVOR） 平均为87%；实验Ⅰ组HVOR为26%，VVOR为21%；损伤对照组HVOR、VVOR均为0。实验Ⅰ组大鼠观察到异常的眼球活动，即水平方向刺激时出现眼球垂直运动，垂直水平刺激时出现眼球水平运动；实验Ⅱ组大鼠则无眼球异常运动现象出现。

    2.2    中脑运动神经元数量和分布 （表1，图1）    术后1、12、24周，右侧上直肌注射HRP逆行追踪标记中脑动眼神经核的运动神经元数量见表1。术后第1周，各实验组、损伤对照组均未见神经元染色。电镜下各组中脑神经元均未见凋亡征象。

    2.3    新生神经纤维数量和直径 （图2，表2）    术后24周，正常动眼神经由两种结构和直径不同的有髓鞘神经纤维组成，呈双峰分布。正常动眼神经总数量为1 668 ± 64.0，其中直径为6~14 μm的神经纤维数量为1 147 ± 96.3，占总数的69%，髓鞘厚度平均为 （1.63 ± 0.18） μm；直径1~5 μm神经纤维数量为521 ± 96.3，占总数的31%，髓鞘厚度平均为 （0.62 ± 0.07） μm。

    3    讨    论

    2003年，我科报告手术成功修复了动眼神经、滑车神经[2]，但术后关于动眼神经支配的眼外肌运动功能恢复并不理想。为了探索动眼神经损伤后功能重建的可能机制，国内外学者进行了大量的动物实验研究，各家报告中有关动眼神经再生后眼外肌的运动功能恢复程度差异很大，且眼外肌常出现异常的运动，具体原因不明。本实验将成年大鼠的动眼神经分别在其近端 （天幕） 和远端 （眶上裂） 切断并立即修复，术后24周，通过前庭眼反射测量眼外肌在水平和垂直方向的运动幅度来评估动眼神经的躯体运动功能；术后12~24周，分别对新生的动眼神经组织切片行组织学研究，并在大鼠损伤侧的上直肌注射HRP，逆行追踪支配眼外肌的动眼神经躯体运动神经元在中脑的分布规律，来研究新生神经纤维对眼外肌的特异性支配与眼外肌运动功能之间的关系。

    本研究发现：术后24周，在眶上裂修复损伤动眼神经的SD大鼠，其眼外肌运动功能恢复的程度明显优于在幕下修复动眼神经的大鼠，且无眼球异常运动；在幕下修复动眼神经的大鼠，不仅其眼外肌运动功能恢复较差，而且在水平方向刺激时出现眼球垂直运动，在垂直水平刺激时出现眼球水平方向运动。该结果说明：动眼神经的损伤部位距离靶器官越近，神经功能恢复也越好。其原因仍不明了，有学者认为可能是神经损伤后中脑的动眼神经运动神经元数量减少所致[6，8-9]；也有学者认为神经损伤后，中脑动眼神经核团内神经元的重新分布导致了神经功能恢复不理想[10]；还有学者认为是新生神经纤维对靶器官重新支配特异性差，导致神经功能恢复不佳。目前仍无某种观点被广泛接受。

    我们将HRP注射到实验大鼠的上直肌，通过新生神经纤维轴浆运输机制逆行追踪支配上直肌的运动神经元在中脑的分布情况。实验发现：与正常大鼠比较，两个实验组大鼠在中脑的神经元数量均显著减少；两个实验组间大鼠的神经元数量差异无统计学意义。因此，我们认为：支配动眼神经的神经元数量可能并不是导致两个实验组大鼠动眼神经功能恢复存在差别的主要原因。对于神经损伤后神经元数量减少的原因，有学者认为是由于神经纤维切断后，损伤信息反馈到神经元导致神经元细胞凋亡所致[10]。但电镜下我们并未发现中脑神经元细胞出现细胞核浓缩、包含体吞噬、溶酶体增多、细胞膜皱缩等凋亡现象，也未发现凋亡小体。因此，我们认为：由于动眼神经切断后眼外肌失神经支配，引起眼外肌萎缩，导致中脑部分运动神经元很难被标记，而标记的神经元数量减少并不是决定神经功能恢复水平的关键因素。

    通过HRP逆行追踪染色大鼠动眼神经运动神经元在中脑两侧的分布，我们发现：正常大鼠支配眼外肌的神经纤维96%由对侧中脑运动神经元发出；在幕下切断并修复动眼神经的实验Ⅰ组大鼠中，其支配上直肌的神经纤维只有45%~51%由对侧中脑运动神经元发出；实验Ⅱ组大鼠支配上直肌的神经纤维81%~87%由对侧中脑运动神经元发出，神经元在中脑的分布更加接近正常大鼠，这可能是实验Ⅱ组大鼠的动眼神经功能恢复较好的原因。因此，我们推测：支配眼外肌的神经元在中脑的重新排布可能是影响神经功能恢复的重要因素。以往的研究也发现：动眼神经切断后，神经断端的近侧和远侧神经轴突均出现变性坏死，中脑的神经元不断发出新生神经纤维，从损伤近端以芽生的方式延伸到远端，直至靶器官，在延伸过程中神经纤维不断重新组合，在此过程中，部分神经纤维盲目对接，导致了对眼外肌的异常支配，因而眼外肌运动功能恢复差且出现异常运动。在实验Ⅱ组大鼠中，由于神经损伤部位离靶器官较近，支配上直肌的新生神经纤维再组合和盲目对接的程度可能较低，大部分的新生神经纤维仍然能够特异性支配靶器官，因此，其眼外肌功能恢复更好。总之，我们认为：新生神经纤维的正确对接和支配眼外肌是影响神经功能恢复的重要因素之一。

    有学者[11]提出：神经损伤后眼外肌可能释放信息分子，诱导新生的神经轴突正确连接眼外肌；损伤部位离靶器官越近，这种信息分子浓度越高，其诱导了更多的新生轴突正确连接靶器官。但这种信息分子论并没有得到实验证实。还有学者认为外源性神经生长因子可能是改善损伤后动眼神经功能恢复的主要原因，但该观点亦未得到普遍认可。我们认为：动眼神经损伤后，如何避免新生的神经纤维盲目对接、错误支配靶器官，是促进神经功能恢复关键的步骤。这可能是今后研究的方向。

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