恶性脑肿瘤干细胞研究进展

      作者：陈娟，陈建    作者单位：226001 南通大学附属医院神经外科

      【关键词】  恶性脑肿瘤干细胞

      恶性脑肿瘤是神经外科常见的疾病，其生长迅速且呈浸润性，目前尚缺乏有效的治疗方法，预后差。据2004年美国癌症协会报道，全美每年确诊18 000例为原发恶性脑肿瘤，其中仅1/3的生存期超过五年［1］，复发一直是困扰临床医生的难题。目前，肿瘤的分子和细胞机制已成为研究的重点内容，脑肿瘤与神经干细胞之间存在密切关系的发现，为研究提供了新的切入点，也为探讨脑肿瘤尤其是恶性脑肿瘤的起源、发生和生长提供了重要的思路。现就恶性脑肿瘤干细胞的研究现状综述如下。

    1  干细胞与神经干细胞

    干细胞在功能上被定义为能自我更新、具多向分化潜能的细胞，按其来源和分化潜能可分为三类：胚胎干细胞、生殖干细胞及成体干细胞。以往认为，哺乳动物包括人神经系统的神经细胞在出生后不久就丧失其再生能力，成人神经细胞一旦损伤就不能再生。然而，1992年，Rynolds和Weiss首先从成体小鼠的脑旁侧室膜下神经组织中，分离出了能在体外不断分裂增殖、具有多种分化潜能的细胞群，并提出神经干细胞的概念。近年来发现成人神经系统内仍然存在一些具有自我更新及分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞能力的细胞，因而被称为神经干细胞，突破了以往的认识。

    2  肿瘤干细胞与脑肿瘤干细胞

    肿瘤干细胞（tumor  stem cells）主要是根据肿瘤细胞和干细胞都具有自我更新能力的相似性而提出的。早期研究表明白血病患者体内仅有一小部分白血病细胞能在体外或体内增殖形成细胞集落， Hamburger［2,3］等发现在肺癌、卵巢癌与神经母细胞瘤中，有1/1 000～1/5 000的细胞可以在体外软琼脂培养基上形成克隆的能力，并推测这可能是一种“癌干细胞”。 Reya［5］等提出的肿瘤干细胞学说认为很多肿瘤都存在三种细胞，即：为数不多，具有多向分化潜能，起关键作用的特殊细胞；快速分裂、扩增的前体细胞；分化成熟、走向凋亡或死亡的细胞，并把前者称为肿瘤干细胞。目前肿瘤干细胞研究中具有代表性的研究是Bonnet分离出白血病造血干细胞［2］及Al Hajj分离出乳腺癌干细胞［4］。

    最近，有文献报道成功地培养出了脑肿瘤干细胞，然而在称呼上尚不统一，Singh 称之为脑肿瘤干细胞；Houman称之为肿瘤来源的前体细胞；Kondu称为小群非主流细胞。其中脑肿瘤干细胞较为合理，容易被人接受。

    恶性脑胶质瘤中通常包括分化和未分化细胞，有时分化的细胞同时表达胶质细胞和神经元的标记物，这表明脑肿瘤组织中存在多潜能神经干细胞样的细胞，即脑肿瘤干细胞。大量的研究表明，脑肿瘤干细胞和正常的神经干细胞有很多极为相识的特征：在功能上都具有自我更新和多向分化的潜能；在体外培养的条件下都可以呈悬浮球样生长；都表达CD133和Nestin蛋白等共同的表面标记；都表达ABC转运体，能将多种化疗药物转运出胞外，从而逃避化疗药物的杀伤；都能迁移到各种不同的组织且有相识的归巢和转移途径；存在相似的调节自我更新的信号转动途径，如Wnt、Shh(sonic hedgehog)、Bmi1、Notch途径等。但脑肿瘤干细胞和正常的神经干细胞之间也有显著的不同：肿瘤干细胞丧失了细胞增殖的负反馈调节机制，其增殖的能力明显强于神经干细胞［6］；倾向于积累复制的错误脑肿瘤干细胞缺乏分化成熟的能力，在促分化的条件下分化成亲本肿瘤的表型，而神经干细胞则按比例分化成神经元和胶质细胞等；脑肿瘤干细胞还存在着核型的异常。

    3  脑肿瘤中存在干细胞的证据

    3.1  体外培养  Singh［7］等发现包括髓母细胞瘤、星形细胞瘤及室管膜瘤等脑肿瘤中几乎所有的细胞均由一小部分表达CD133+（人类干细胞标志物）的细胞，即脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell，BTSC）增殖产生。将表达CD133+和Nestin蛋白的细胞在体外促分化条件下培养，这些细胞呈现贴壁生长，并增殖分化为神经元和胶质细胞，其比例和表型与原肿瘤一致，同时核型分析证实这些细胞存在染色体的异常，即10号和16号染色体缺失，18号染色体增加，核型为45XY，提示这些细胞可能由正常NSC突变而来，从而证实了它们是肿瘤细胞而非神经干细胞的污染。同样Hemmati等［8］采用相似的方法在髓母细胞瘤和恶性胶质瘤细胞中也分离出一种肿瘤细胞来源的前体细胞，除具有自我更新及多向分化的能力外，同时也表达多个干细胞特异性的基因，如Nestin、CD133、musashi1和bmi1等，把这类细胞移植到新生小鼠纹状体后，它们能发生迁移并分化为神经元和胶质细胞。

    3.2  体内研究  判断BTSC存在与否最有力的证据是明确脑肿瘤细胞是否能在体内产生与来源相同的肿瘤。Galli等［9］通过研究发现，髓母细胞瘤中存在具备 NSC主要特性的祖细胞，在培养基中可以增殖、自我更新，并能分化成多细胞谱系；将这种细胞注射入小鼠颅内可在活体内产生与原肿瘤类似的肿瘤，重复操作可以在另一只小鼠体内产生表型相似的肿瘤。为进一步研究脑肿瘤干细胞在体内是否可以产生肿瘤，Singh［10］等采用免疫磁珠法从髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤组织中分离出CD133+和CD133-的细胞，将其移植入NOD/SCID小鼠的脑内，比较这两种肿瘤细胞致瘤能力的差别，结果移植12～24周后，发现仅100个 CD133+的肿瘤细胞就可以在小鼠体内形成肿瘤，而移植50 000～100 000个CD133的肿瘤细胞仅在移植部位形成一条胶质疤痕，紧接着将子代肿瘤中CD133+的肿瘤细胞分离后，再移植入小鼠体内，5周后5只小鼠均可见肿瘤的发生，且其表型与亲代的肿瘤相同。这提示脑肿瘤干细胞有连续传代及致瘤的能力。上述结果说明，脑肿瘤中的 CD133＋细胞比CD133细胞具有更强的致瘤能力，进而为脑肿瘤干细胞的存在提供了证据。李茗初等采用悬浮法培养C6胶质瘤细胞系，也从中分离出一种比例低（仅占1.18%）但却具有增殖和分化能力，并能在体外维持细胞系的肿瘤细胞，即肿瘤干细胞。同样，王金鹏等也在人脑胶质瘤SHG44细胞系中证实了脑肿瘤干细胞的存在。近来还有研究发现［11］，某些干细胞和肿瘤细胞可以将一种脂溶性的DNA结合染料Hoechest 33342排出细胞，利用该特性分离的这部分细胞就叫做SP细胞。现已发现SP细胞不仅可以在人、猪、鼠的造血系统中表达，在骨骼肌、脑组织等非造血系统，以及胚胎干细胞中也有一定的比例。根据其存在的广泛性和表型的保守性，推测SP表型可以作为鉴定不同组织来源的干细胞的新标志。随后，Kondo T等［12］证实在小鼠C6胶质瘤细胞系及小鼠神经母细胞B104等细胞系中存在0.4%～2.0%不等的SP细胞，进一步研究发现C6胶质瘤细胞系中的SP细胞其不仅可以在培养基中产生SP细胞和非SP细胞，并能在裸鼠体内形成含有神经元和胶质细胞的肿瘤。

    4  脑肿瘤干细胞的来源

    肿瘤干细胞在肿瘤组织中起主要作用，其通过现在还未明确的机制不断分裂增殖，一方面更新自身，另一方面产生出具有有限分裂和分化能力的肿瘤细胞，推动了肿瘤的形成。一旦调节正常干细胞及其前体细胞的信号转导通路发生异常，就会失去严密的自我更新调节能力，高度活跃、生存期长，更可能发生基因突变并不断积累，而向恶性转变形成肿瘤。有文献报道［13］单个细胞经过4～7次基因突变就有可能发生恶性转变，组织更新快复制转录过程中发生基因突变的概率就越高。在干细胞发生恶性转变后，其分化成熟能力受阻，分裂、增殖能力增强，形成肿瘤［13］。

    众所周知成人的神经干细胞主要在侧脑室壁和海马的齿状回，而脑肿瘤则可见于脑组织的任何部位，对此Recht等［14］比较了早期病变和肿瘤组织中的 Nestin 阳性细胞，发现两者存在差异，认为室管膜下区是神经干细胞发生恶性转变（永生化）的重要场所，但不是最后场所，部分恶性转变（永生化）的神经干细胞迁移至室管膜下区之外的脑实质中，继续完成恶性转变。至于形成星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤还是其他类型的肿瘤，可能与局部环境有关。Berger 等［15,16］认为，神经干细胞经不对称分裂形成一个新干细胞和一个前体细胞。在原癌基因被激活的神经干细胞（突变干细胞），蛋白激酶使癌基因的表达产物磷酸化，并沉淀于细胞的一侧，不对称分裂时形成的前体细胞继承所有癌基因表达产物，并迁徙至远处的脑实质，继续恶性转变，形成肿瘤灶；而子代干细胞中的癌基因产物则被清除，继续留在室管膜下区。由此可见，突变的神经干细胞在微环境（蛋白激酶等）的影响下，源源不断地提供向远处迁徙、能形成肿瘤的前体细胞。Recht 的研究结果和不对称分裂的假说均揭示：脑肿瘤的根源在室管膜下区，而肿瘤形成却在室管膜下区之外的脑实质。这一理论一方面为脑肿瘤易复发，难根治提供了新的解释；另一方面也提出了如下问题: 脑肿瘤干细胞到底来自神经干细胞还是前体细胞？如果脑肿瘤干细胞来自突变的前体细胞，则意味脑肿瘤干细胞和神经干细胞不处于同一分化层次，那么鉴别两者的分化相关标记物是什么？脑室周围是不是真的存在突变的神经干细胞？

    从分子角度来看，肿瘤的发生与细胞调节自我更新的信号转导途径异常有关，其中Bmi1、Notch、Wnt和Sonic hedgehog(shh)等信号转导途径在调节神经干细胞和祖细胞的增殖过程中起重要作用。在生理条件下，当组织因各种原因受到损伤时，其信号传导通路被激活，完成必要的更新后，相应的通路就关闭，这一过程受到严格的调控，但在某种致瘤因素下发生基因突变时，这些信号转导异常活化，而分化成熟受阻，从而诱发肿瘤。现已证明Wnt、shh通路的异常与髓母细胞瘤的发生密切相关，同时也有研究显示运用其信号通路的抑制剂，可以导致小鼠体内的移植瘤衰退，并能诱导手术切除的髓母细胞瘤细胞迅速凋亡［17］。但具体机制尚未明了。

    5  研究脑肿瘤干细胞对肿瘤诊断和治疗的意义

    目前对肿瘤的治疗主要靠传统的三大治疗手段（手术、放疗、化疗），但这些只能减小肿瘤体积、降低颅内压等，不能够有效防止肿瘤的转移和复发。除了由于肿瘤细胞产生耐药性之外，更可能因为传统治疗方法均主要针对大部分没有增殖和自我更新能力的肿瘤细胞，不能够有效杀死肿瘤干细胞，每次治疗后残存的肿瘤干细胞成为肿瘤复发和转移的根源。肿瘤干细胞的发现让肿瘤治疗有了更明确的目标。随着对肿瘤干细胞生物学研究的深入，可能研制出拮抗肿瘤干细胞异常信号传导途径的靶向药物和诱导肿瘤干细胞分化的药物。Kucia M等［18］认为肿瘤干细胞和正常干细胞在体内的迁移均由SDF1CXCR4轴调节控制，表达CXCR4的肿瘤干细胞能够向高表达SDF1的组织（淋巴结、肺、肝、骨）迁移。提出通过调节 SDFCXCR4轴来抑制肿瘤干细胞的转移，从而达到治疗肿瘤的目的。

    目前脑肿瘤的诊断和预后的判断，主要依赖光镜下肿瘤细胞的形态特点、免疫组化的表现以及核分裂相的多少来判断，然而这并不能充分说明肿瘤干细胞这一对肿瘤生物学特性至关重要的组分的情况。肿瘤干细胞可能存在的特异性标志将有助于肿瘤的诊断和预后判断，另外可通过对肿瘤干细胞在肿瘤细胞中比例的判定来较为准确地判断预后。这方面研究已经有所进展，Glinsky GV等［19］用微陈列（microarray）技术从远处转移的前列腺癌细胞中筛选出11个与促进Bmil表达信号途径相关的基因，这些基因在远处转移的前列腺癌细胞中的表达情况分析图和干细胞相似，能够准确预测患者是否会出现肿瘤早期复发、远处转移。

    6  研究中有待解决的问题

    目前针对脑肿瘤干细胞的研究还刚刚起步，方兴未艾，有许多未知的领域需要我们去探索。首先，既然脑肿瘤干细胞来源于神经干细胞，那么到底是什么原因导致了基因突变？他们表达的产物又是如何发挥作用的？其次，目前针对脑肿瘤干细胞的鉴定技术主要来自对正常神经干细胞鉴定的方法，既然要以肿瘤干细胞为中心发展靶向性的治疗，如何去寻找其专属性的标记物？另外，神经干细胞对神经肿瘤干细胞的生长是否有抑制作用？如有，神经干细胞移植对神经肿瘤是否有治疗作用？

    总之，肿瘤干细胞理论的提出使人们对肿瘤的认识提高到一个新的水平，为我们认识恶性脑肿瘤提供了一条崭新的途径，然而面临的问题也很多，需要我们共同去努力攻克。

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