N乙酰半胱氨酸对大鼠颅脑损伤后ICAM1和NFκB表达的影响

　　作者：雷鹏，张卫民，贺建勋    作者单位：兰州军区兰州总医院神经外科，甘肃 兰州 730050

　　【摘要】  目的 观察N乙酰半胱氨酸（NAC）对大鼠颅脑损伤后细胞间黏附因子1（ICAM1）和核转录因子κB(NFκB)表达的影响，探讨其脑保护机制。方法 90只Wistar大鼠随机分为假手术组(n=6)、颅脑创伤组(n=42)及颅脑创伤NAC干预组(n=42)。采用自由落体法建立大鼠颅脑创伤模型，应用免疫组织化学法检测NFκB和ICAM1表达的变化。结果 与假手术组相比，脑损伤组NFκB和ICAM1表达水平明显升高，NAC可降低NFκB和ICAM1表达，减轻炎症反应。结论 NAC可能通过抑制NFκB和ICAM1的表达，减轻炎症反应，发挥脑保护作用。

　　【关键词】  颅脑损伤 N 乙酰半胱氨酸 核因子 κB 细胞间黏附因子 1

　　Effect of Nacetylcysteine on nuclear factorκB and intercellular adhesion molecules1 expression after traumatic brain injury in rats

　　LEI Peng,ZHANG Weimin,HE Jianxun

　　(Department of Neurosurgery，PLA General Hospital，Lanzhou  730050，China)    　　Abstract：  Objective  To explore the effect of NAC on NFκB and ICAM1 expression after traumatic brain injury(TBI) in rats,and discuss the mechanisms of neuroprotection by NAC.Methods  Ninety adult male Wistar rats were randomly divided into sham group(n=6),TBI group(n=42) and NAC group(n=42).The experimental TBI model was established by Feeney's method.Samples were obtained after injury for inspecting the expression of ICAM1 and NFκB proteins by immunochemical method.Results  Compared with the sham group, the expression levels of ICAM1 and NFκB were significantly increased after traumatic brain injury,and NAC significantly decreased the expression of ICAM1 and NFκB.Conclusion  Expression of NFκB and ICAM1 decreased by NAC might be one of the mechanisms in regulating ICAM1,NFκB level and inhibiting inflammation in cortex and exerting protective function to neurons.    　　Key words：brain injury;Nacetylcysteine(NAC);NFκB;ICAM1    　　研究表明脑损伤后适量的核转录因子(NFκB)表达水平可抑制神经细胞凋亡，具有脑保护作用，但其过度激活常导致其它炎性细胞因子的过度表达，导致严重的继发性脑损害［1，2］。细胞间黏附因子1（ICAM1）可介导多种炎症细胞黏附于血管内皮细胞，是多种炎性因子发挥作用的分子基础［3］，同时ICAM1的表达又受到包括NFκB在内的多种因子的调节。N乙酰半胱氨酸(NAC)是一种含有巯基的还原剂，具有稳定细胞膜、保护细胞活性和清除活性氧等作用［4］，在减轻心、脑、肝等脏器的缺血再灌注损伤中的作用日益受到关注，而在创伤性颅脑伤中的作用研究较少，本试验旨在观察NAC对大鼠颅脑损伤后伤侧脑组织内NFκB和ICAM1表达的影响，探讨有关的作用机制，以期为临床治疗提供理论依据。

　　材料与方法

　　1  主要仪器、试剂和实验动物    　　Dympus DP70成像系统，Imageproplus 5.0(IPP5.0)数据分析系统，NAC（Sigma公司），大鼠立体定向仪(江湾Ⅱ型,上海)，ICAM1多克隆抗体（兔抗）（北京博奥森生物技术有限公司）；NFκB p65(F6)：sc8008(鼠抗)（Santa Cruz公司），二步法免疫组化试剂盒(抗鼠和抗兔IgG  PV6001/6002)、SP试剂盒和DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；3月龄健康雄性Wistar大鼠，SPF级，体重(260±20)g（甘肃省中医学院动物实验中心提供）。

　　2  实验动物分组及模型制备    　　随机分为假手术组(sham组，n=6)、颅脑创伤组（TBI组，n=42）及NAC干预组（NAC组，n=42），后2组分别分为3、12、24、48、72小时、5、7天组，每组6只。采用改良Feeney's自由落体硬膜外撞击法制作颅脑损伤模型［5］，致伤冲击力为1000g/cm。假手术组除不打击外，其它步骤同创伤组。NAC干预组于颅脑损伤后立即经腹腔注入NAC150mg/kg， 颅脑创伤组于伤后经腹腔注射等量生理盐水。大鼠清醒后笼中饲养，自由进食水。

　　3  标本采集与检测    　　Sham组于伤后24小时取材，余2组在伤后相应时间点分别取材。将大鼠深度麻醉后固定于动物实验台上，剪开胸腔，以生理盐水150ml和4%多聚甲醛150ml先后经左心室灌注固定，同时剪开右心耳。之后完整取出脑组织，冠状切取损伤灶处具有完整皮层的组织固定、石蜡包埋，4μm连续切片备用。免疫组化采用SP法测定NFκB表达水平、采用二步法测定ICAM1的表达，一抗均按1：150稀释，分别严格按SP和二步法试剂盒说明书操作。    　　免疫阳性染色细胞和血管显微镜下表现为深黄色或棕褐色。在Dympus DP70成像系统高倍光学显微镜下（×400），每张切片任选6个非重叠高倍视野进行观察，对ICAM1免疫染色血管进行计数并计算平均值，NFκB免疫组化染色标记强度用光密度值(optical density,OD)表示，比较各组OD值。

　　结果

　　1  ICAM1表达的变化     　　ICAM1免疫阳性染色表现为深黄色或棕褐色，主要定位于血管内皮细胞，且主要集中在皮层血管，脉络丛只有少量免疫染色血管（图1a、b和c、d）。NS对照组伤后3小时即可见免疫染色血管开始增多，12小时明显增多，72小时小时达到高峰，之后开始下降，7天时可见明显下降。与sham组相比，TBI组和NAC组3小时组阳性血管数虽有升高，但均无统计学意义（P>0.05），余各时间点均明显增高，有非常显著性差异（P<0.01）；NAC组与TBI组相比，3小时组免疫阳性血管数无明显减少（P>0.05），12小时和7天组时，免疫阳性血管数减少，有显著性差异（P<0.05），24、48、72小时和5天组可见免疫阳性血管数明显减少，有非常显著性差异（P<0.01)（见图2）。

　　2  NFκB蛋白表达的变化    　　NFκB阳性染色定位于胞浆和(或)核膜，呈黄色或棕黄色(图1e、f和g、h)。颅脑损伤后3小时在伤侧脑组织中即可见NFκB表达，12小时表达明显升高，24小时达高峰，后表达水平逐渐下降，与sham组比较均有非常显著性差异(P<0.01)；NAC治疗组伤后NFκB表达自3小时即明显下降，与损伤12、24、48、72小时组相比，NFκB表达显著下降，差异非常显著(P<0.01)，与损伤5天和7天组相比差异显著(P<0.05)(见表1)。    　　a、b.分别为TBI组的24小时和72小时组伤侧脑组织ICAM1的表达变化；c、d.分别为NAC组相应时间点ICAM1的表达变化(如箭头所示)；e、f.分别为TBI组的24小时和48小时组伤侧脑组织NFκB的表达变化；g、h.分别为NAC组相应时间点NFκB的表达变化(如箭头所示)

　　图1  颅脑损伤后ICAM1和NFκB表达变化(SP  ×400)（略）    　　与TBI组相比：*P<0.01,@P<0.05；与Sham组比较：#P<0.01,$P>0.05 ；与sham组和TBI组比较：**P>0.05

　　图2  NAC对大鼠颅脑损伤后不同时间点伤侧脑组织ICAM1表达的影响（略）

　　表1  NAC对大鼠颅脑伤后不同时间点伤侧脑组织NFκB表达的影响（略）

　　与TBI组比较：*P<0.01，ΔP<0.05；与sham组相比：＃P<0.01

　　讨论    　　抗氧化剂NAC具有直接清除氧自由基作用，其脱乙酰基后成为谷胱甘肽合成的前体，能增加细胞内谷胱甘肽的水平，增强组织的抗自由基作用，并能稳定细胞膜结构，稳定谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶，保持其活性，并对诱导型氧化氮合酶mRNA的表达有抑制作用，进而减少NO的产生［6］。本研究结果显示,NAC干预治疗可以减轻局灶性脑损伤的炎性反应，减少脑组织NFκB及ICAM1的表达，提示NAC可能通过调节NFκB及ICAM1对脑损伤起到神经保护作用。    　　创伤性脑损伤后的继发性脑损害与很多因素有关，炎症反应能够促进继发性损害，是继发性脑损伤的主要原因之一［7］。NFκB是炎症反应的一个重要信号转导分子，在脑损伤的炎症反应中起中心环节的作用［8］，能诱导炎症因子的表达与凋亡。在正常情况下，大多数细胞中NFκB与其抑制因子IκK、IκB蛋白结合，滞留于细胞浆中，而不能转入细胞核内，因此不具有转录性。颅脑损伤后，多种原因引起NFκB与其抑制蛋白脱离后转入细胞核内进而被激活，发挥其对多种炎症因子的调节作用。本试验在脑创伤NAC干预后，损伤侧脑组织内NFκB在核内的表达水平明显降低，其可能机制为NAC可能通过促进NFκB与其抑制因子IκK、IκB蛋白结合，从而抑制NFκB活化，这就阻止了多种炎症递质基因上调，减轻脑损伤的炎症反应。另外，活化的NFκB可直接调控参与脑损伤后炎性损伤的包括ICAM1在内的多种炎性介质的表达。    　　ICAM1是中枢神经系统中细胞表达最广泛的黏附分子，几乎所有的脑细胞均有ICAM1的表达,有跨膜及可溶性蛋白(sICAM1)两种形式。颅脑损伤后在脑组织内表达水平明显上升，可介导多种炎症细胞黏附于血管内皮细胞，特别是脑损伤的急性期，此时多种炎性细胞因子表达增加，其白细胞介素1（IL1）、白细胞介素6（IL6）、白细胞介素8（IL8）、肿瘤坏死因子α（TNFα）和干扰素г等主要促进水肿和炎症反应，而黏附分子则是它们发挥作用的分子基础［9］。研究显示［10］，许多炎性因子可直接或间接使ICAM-1在炎症反应中表达上调，其中首推NFκB，其次为TNFα、IL6、IL8、IL1β等许多炎性因子。NFкB是参与炎症反应调控的重要核转录因子。近年来研究表明［11］，NFκB能够结合到ICAM1基因的启动子上,使其表达上调，促进缺血区白细胞浸润，诱导缺血性脑损伤。许多炎性因子又可通过NFκB来调控黏附因子的基因表达。本试验中发现，脑损伤后NFκB表达高峰先于ICAM1表达高峰，说明高水平的NFκB表达可能启动了ICAM1的基因表达上调，从而上调了ICAM1的表达水平；而当NAC干预后，NFκB表达高峰明显降低，ICAM1表达高峰也明显降低，说明NAC可能通过降低NFκB的表达，继而使ICAM1表达减少；也可能NAC通过其抗氧化作用直接降低ICAM1的表达水平，从而减少其炎症反应的介导作用，减轻脑损伤后的继发性损害，发挥脑保护作用。    　　综上所述，NAC可能通过自身的抗氧化作用和清除氧自由基等特性，抑制脑损伤后NFκB的表达,继而下调ICAM1的表达,抑制炎症反应,对创伤性脑损伤起一定程度的保护作用。但最近研究显示［12］，脑损伤后一定水平的NFκB的活化向核内易位后，可增加抗凋亡因子（survivin）的合成和分泌，从而阻断细胞凋亡过程，发挥脑保护作用。因此，我们且莫盲目过分抑制脑损伤后NFκB的表达活性，NFκB可能为“双刃剑”的角色，即过度的表达可能促进严重的继发性炎性脑损伤，而一定水平的表达可能通过其阻断凋亡过程，发挥脑保护作用。所以，如何应用NAC调节NFκB的表达活性，以达到生物效应平衡状态，发挥其最大的脑保护作用，还需进一步进行探讨。

【参考文献】  　 ［1］Kassed CA,Willing AE,GarbuzovaDavis S,et al.Lack of NFkappaB p50 exacerbates degeneration of hippocampal neurons after chemical exposure and impairs learning［J］.Exp Neurol,2002,176(2):277-288.

　　［2］Yamazaki S,Muta T,Takeshige K.A novel IkappaB protein,IkappaBzeta,induced by proinflammatory stimuli,negatively regulates nuclear factorkappaB in the nuclei［J］.J Biol Chem,2001,276(29):27657-27662.

　　［3］Hery C,Sebire S,Peudenier M,et al.Adhesion to human neurons and astrocytes of monocytes: the role of interaction of CR3 and ICAM1 and modulation by cytokines［J］.Immunol,2005, 57（2）:101-109.

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　　［12］雷鹏，彭龙锋，张兴超.重组人促红细胞生成素对大鼠颅脑损伤后Survivin表达的影响［J］.中国临床神经外科杂志，2007，12（6）：350-353.