钙通道阻滞剂对大鼠坐骨神经损伤后cfos表达及神经功能的影响

　作者：张晓玲, 唐金荣，苏建华，曾彦英，张平，朱学江，吴乐，肖杭    作者单位：210029南京医科大学第一附属医院神经内科

　【摘要】  目的 探讨钙通道阻滞剂（CCB）对周围神经损伤后cfos表达及神经功能的影响。方法 制作坐骨神经嵌压性损伤大鼠模型，给予模型大鼠分别腹腔注射氟桂利嗪1 mg/kg（低剂量组）、2 mg/kg（高剂量组），或生理盐水10 ml/kg（模型组）。在坐骨神经嵌压后第1周、第4周时取大鼠坐骨神经，采用免疫组织化学、行为医学和电生理学的方法测定cfos阳性细胞数及第4周时足趾间距、神经传导速度（NCV）；并与正常大鼠比较。结果 （1）损伤后1周时，模型组、氟桂利嗪低剂量组坐骨神经cfos阳性细胞数显著多于正常对照组（均P<0.01）；氟桂利嗪高剂量组 cfos阳性细胞数轻度增加，也显著多于正常对照组（P<0.05），但明显少于模型组和氟桂利嗪低剂量组（均P<0.01）；损伤4周时各组cfos阳性细胞数均无明显增高。（2）损伤后4周时，模型组和氟桂利嗪低剂量组、高剂量组坐骨神经NCV显著慢于正常对照组（均P<0.01），氟桂利嗪低剂量组、高剂量组的NCV快于模型组（P<0.05，P<0.01）。（3）损伤后4周时，模型组大鼠右后肢足趾间距明显小于其他3组（均P<0.01）；氟桂利嗪高剂量组、低剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。结论 CCB使周围神经损伤后早期cfos表达下调，并使神经功能受损减轻。

　【关键词】  钙通道阻滞剂；坐骨神经；嵌压性损害；cfos；神经传导速度

    Effects of calcium channel blocker on the cfos expression and nerve function following sciatic nerve injury in rats  ZHANG Xiaoling, TANG Jinrong, SU Jianhua, et al. Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029, China

    Abstract：Objective  To study the effects of calaium channel blocker(CCB) on cfos expression and nervous function following peripheral nerve injury. Methods  Sciatic nerve was crushed with pincers to make the models of sciatic nerve crush injury in rats. The model rats were administered with Flunarizine 1 mg/kg(low dose group), 2 mg/kg(high dose group) and normal saline 10 ml/kg(model group) via intraperitoneal injection. The cfos positive cells at 1st and 4th week and nerve conduction velocity of sciatic nerve, distance between right behind toes were examined at 4th week respectively by immunohistochemical, behavior and electrophysiologic techniques. The results were compared with normal rats.  Results  (1) The cfos positive cells were higher significantly in model and Flunarizine low dose groups compared with normal control group (all P<0.01) at 1st week after crush injury. The cfos positive cells increased slightly in Flunarizine high dose group, it was higher than that in the normal control group (P<0.05) and lower than that in the model group  and Flunarizine low dose group(all P<0.01) at 1st week after crush injury. There was no increased of it in all groups on 4th week after crush injury. (2) The nerve conduction velocity of sciatic nerve in model group, Flunarizine low and high dose groups were slower than that in the normal control group (all P<0.01), while it was faster in Flunarizine low and high dose groups than that in the model group (P<0.05,P<0.01) on 4th week after crush injury. (3) The distance between right behind toes in model group was smaller than those in the other 3 groups (all P<0.01), while it was no significant  difference between Flunarizine low and high dose groups and the normal control group (all P>0.05).  Conclusion  The cfos expression following peripheral nerve injury can be reduced by CCB , which has the protective effect on the damaged peripheral nerve function.

    Key words：calaium channel blocker; sciatic nerve;  crush injury;  cfos;  nerve conduction

    周围神经损伤后cfos基因表达增加是参与冲动传导的轴突对伤害性刺激的反应；有学者［15］提出利用一定形式的刺激，并通过检测cfos表达部位及程度，可以了解参与这一刺激传导神经的受损状态。各种不同性质的致病因子最终均导致细胞外钙离子内流使神经功能受损，早期使用钙通道阻滞剂（CCB ）可保护神经功能［6，7］。为进一步探讨CCB对周围神经嵌压性损害保护作用的机制，本研究在Patro 等［8］实验研究的基础上，应用免疫组织化学、行为医学、电生理学方法从不同侧面探讨CCB对坐骨神经损害的保护作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物与分组  SD大鼠64只，雌雄各半，质量180～220 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。随机分为正常对照组、神经损伤模型组（模型组）、氟桂利嗪低剂量组和高剂量组；每组16只。

    1.1.2  主要试剂、药品与仪器  氟桂利嗪（西安杨森），Triton X100液，蔗糖，葡萄糖氧化酶，0.05%二氨基联苯胺（DAB，Sigma，美国），卵白素生物素过氧化酶复合物（ABC，1:150，Sigma，美国），羊抗Fos抗体（1∶2000，Cambridge research biochemical,英国），Weil苏木精（10%纯乙醇性苏木精5 ml，4%铁明矾50 ml，蒸馏水45 ml），weigert分化液（硼砂2 g，铁氰化钾2.5 g，蒸馏水200 ml），外科手术器械一套，常规神经分离设备一套，Leitzhryomat1700冰冻切片机，D95Super Lab神经干动作电位传导速度测定仪（江苏生物医学工程学会医电研究所）。

    1.2  方法

    1.2.1  大鼠周围神经损伤模型制作［8］  给大鼠3%戊巴比妥（10 ml/kg）腹腔注射麻醉，固定于鼠板上，于右后肢腹股沟处切开，钝性分离肌肉组织，暴露坐骨神经。正常对照组坐骨神经暴露后即关闭切口，其余各组大鼠用其质量一半的重物压住坐骨神经，持续30 s后松开，关闭切口。常规注射抗生素以防感染。模型制作成功后，氟桂利嗪高剂量组、低剂量组分别给予氟桂利嗪2 mg/kg、1 mg/kg腹腔注射（低剂量组用量相当于临床成人用量的5倍），模型组腹腔注射等量（10 ml/kg）的生理盐水。

    1.2.2  cfos阳性细胞数测定  每组各8只大鼠分别于损伤后第1周、第4周处死并分离脊髓、背根神经节、相连的神经根（前、后根）和坐骨神经干［9］。分离的坐骨神经干用4%多聚甲醛灌注，常规方法脱水后石蜡包埋，切成50 μm的切片，用ABC免疫组化法染色，光镜下计数5个高倍(×200)视野的cfos阳性细胞(细胞浆内有核黄素颗粒)数，取其平均值。

    1.2.3  足趾间距的测定  各组大鼠分别于损伤后第4周测量足趾间距。将大鼠双侧后肢沾上墨水，让其在长60 cm、宽10 cm的白纸上自由行走，用游标卡尺测量右后肢3～4足趾的间距。

    1.2.4  坐骨神经传导速度测定  立即快速取6 cm已分离的坐骨神经干，放入神经传导速度测定盒内（盒内恒温35℃），于2 min、3 min、4 min各测定1次。刺激参数：波宽0.04 ms，强度2倍于阈强度（约2.7 V），频率单刺激，扫描速度50000 mm/s。每根神经有两对记录电极，距离恒定为35 mm，测出两对记录电极之间动作电位峰峰的时间，以距离÷时间得到该段坐骨神经的传导速度。该法具有排除系统误差、潜伏期等对速度准确性的影响的优点。

    1.2.5  统计学方法  采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理。数据以均数±标准差(±s)表示，各组神经传导速度均数间比较采用t检验。因各组cfos阳性细胞数近似服从正态分布，采用方差分析进行比较，并用SNK法作两两比较。

    2  结  果

    2.1  各组cfos阳性细胞数比较  正常对照组的坐骨神经有少量cfos阳性细胞；损伤1周时，模型组、氟桂利嗪低剂量组坐骨神经cfos阳性细胞数显著多于正常对照组（均P<0.01）；氟桂利嗪高剂量组 cfos阳性细胞数轻度增加，显著多于正常对照组（P<0.05），但明显少于模型组和氟桂利嗪低剂量组（均P<0.01）。损伤4周时各组cfos阳性细胞数均无明显增高，组间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。表1  各组大鼠坐骨神经cfos阳性细胞数 比较注：与正常对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01；与低剂量组比较▲P<0.01

    2.2  各组大鼠足趾间距比较  见表2。坐骨神经损伤后第4周时，模型组大鼠右后肢足趾间距明显小于其他3个组（均P<0.01）；氟桂利嗪高剂量组、低剂量组与正常对照组差异无统计学意义（均P>0.05）。表2  各组损伤后第4周时足趾间距及坐骨神经传导速度比较 注：与正常对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.05，△△P<0.01

    2.3  各组坐骨神经传导速度比较  见表2。坐骨神经损伤后第4周时，模型组和氟桂利嗪低剂量组、高剂量组坐骨神经传导速度显著慢于正常对照组（均P<0.01），氟桂利嗪低剂量组、高剂量组显著快于模型组（P<0.05，P<0.01）。

    3  讨  论

    本研究结果显示：（1）嵌压SD大鼠坐骨神经后，模型组大鼠损伤后1周时cfos表达显著增加，因为神经干中cfos表达是参与冲动传导的轴突对伤害性刺激的反应［1］；而氟桂利嗪组仅轻度增加，高剂量组尤为明显，这是因为Ca2+作为第二信使可以促进cfos的表达［2］，氟桂利嗪通过阻断Ca2＋内流使早期大鼠坐骨神经cfos的表达下调［1，2］；4周时各组均正常；与既往报道［15］相符。（2）在大鼠坐骨神经损伤后第4周时，模型组坐骨神经神经传导速度减慢及足趾间距减小；但氟桂利嗪组神经传导速度及足趾间距较模型组显著快、大，高剂量组尤为明显（P<0.05～0.01）；与既往报道［1013］相符。

    将本研究的结果进行对比可见：嵌压SD大鼠坐骨神经后，坐骨神经cfos的表达影响后期的神经传导速度，即cfos表达水平愈高则神经传导速度愈慢；CCB则可通过阻断Ca2＋内流使早期cfos表达下调而减轻损伤对神经传导速度和神经功能的影响。细胞分子水平的研究［6，7］亦提示各种不同性质的致病因子最终均可导致Ca2＋内流使神经细胞功能受损。杨志军等［4］提出利用一定形式的刺激，并通过检测cfos表达的部位及程度，可以了解参与这一刺激传导神经的功能状态。Matthews等［14］指出对于维持神经递质的释放和神经元的兴奋性，电压依赖性Ca2＋通道的活性是关键，早期使用CCB（氟桂利嗪）可保护这一重要的功能。最近，Galtrey等［15］报道神经损伤后功能恢复程度与轴索再生方向的正确与否有关，但对早期Ca2＋内流与轴索再生的关系未作论述。有研究［16］指出周围神经损伤后神经功能的恢复取决于多种因素，如损伤早期对神经元的保护、神经损伤修复后神经轴突的定向生长并与远端的效应器形成具有功能性的突触联系等。

    本研究结果提示：周围神经受损后应用CCB（氟桂利嗪）可减少cfos的表达，其机制可能在于CCB阻断了Ca2＋内流过程，使cfos的表达下调，从而保护受损伤神经的功能；由于cfos表达增高只出现在神经损伤的早期，故在神经损伤后应尽早使用CCB。

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