基于微电极陈列的嗅觉神经芯片及其测试系统的研制

　作者：刘峰,郑茜茜,沈小妹,李一乔,凌树才,郑筱祥,叶学松    作者单位：1. 浙江大学生物医学工程与仪器科学学院，生物医学工程教育部重点实验室，求是高等研究院，浙江杭州 310027; 2. 浙江大学医学院人体解剖与组织胚胎学教研室,浙江杭州 310027; 3. 温州医学院信息与工程学院，浙江温州 325000

　【摘要】  目的 研究基于MultiElectrode Array（MEA）构建嗅觉神经芯片及其测试系统的方法,并验证系统获取神经电生理和其他电生理信号的有效性。 方法 首先通过自行研制的72通道神经电信号调理电路和同步采集系统获取MEA芯片上大鼠全心离体心电信号和海马神经网络自发放电生理信号；然后通过此采集系统获取平面MEA芯片上培养新生大鼠嗅球神经细胞而制作成嗅球神经网络细胞芯片的电生理信号，并通过光镜观察嗅球网络生长形态。 结果 基于MEA传感与检测系统有效地获取了不同培养阶段嗅球神经网络形态所对应的电生理信号，能够用来分析神经网络电生理信号的复杂性和时间编码。结论 本文构建的检测平台能够广泛用于神经电生理和神经生物学的研究。

　【关键词】  平面微电极阵列；嗅觉神经芯片；神经网络；神经信号采集

　Development of MEAbased Olfactory Neural Chip and Its Testing System.LIU Feng,ZHENG Qianqian,SHEN Xiaomei,LI Yiqiao,LING Shucai,ZHENG Xiaoxiang,YE Xuesong.Space Medicine & Medical Engineering,2009,22(3):216～220

    Abstract: Objective To find an efficient way for developing olfactory neural chip and its measurement system of electrophysiological signals with Multielectrode Array (MEA), furthermore, to verify the efficiency of this detection system for electrophysiological signals of neural system and others. Methods The acquisitions from electrocardio signals of rat hearts in vitro and from selfissuing signals of hippocampus neural networks on MEA chip, as well the electrophysiological signals of olfactory bulb neural network neuron chips made of cultured neonatal rat olfactory bulb neuron according to different shapes at different culturing periods, were performed with 72channel signal condition circuits and an acquisition system developed in our lab. Those shapes of olfactory bulb networks at different culturing periods were observed and compared by optical microscopy. Results It was apparent that the detection platform integrated with MEA sensors could be used to capture electrophysiological signals of olfactory bulb neural networks at different cultured periods, and those data acquired could be used to analyze complexity and temporal coding of electrophysiological signals of neural networks. Conclusion The neural signal detection platform developed here is capable of being broadly used on the studies of neural electrophysiology and neural biology .

    Key words: planary microelectrode array; olfactory neural chip; neuron network;neuron signal acquisition

    Address reprint requests to：YE Xuesong. College of Biomedical Engineering & Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 310027, China

    动物和人体的嗅觉系统已经有了几百万年进化的历史，它能对大量不同的复杂气味进行辨识。人类嗅觉能够识别和区分含量低至10-12级微量易挥发的不同分子结构的化学物。到底是什么原因使嗅觉系统能对气味进行精确辨识一直是神经信息学研究中的热门课题之一［1］。长期以来，由于嗅觉感受器位置的隐蔽性及其生理的特殊性造成了目前人工感觉系统的发展中人工嗅觉系统的开发水平远低于其它人工感觉系统。在嗅觉系统的研究中，其中具有代表性意义的是Axel和Buck从1991年开始所从事的研究工作，在持续了10余年的研究后，其成果获得了2004年诺贝尔生理学或医学奖。这是人们从分子水平到细胞的组织方式上研究了嗅觉系统，并阐述了嗅觉系统气味识别在空间编码上的识别机理。但是从时间编码的角度来看，特别是嗅觉中枢信息处理的过程及相关的分子机制尚有很多方面有待更进一步深入研究［23］。

    目前，MEA成为系统生物学实验中主要的工具［45］。MEA提供了一个样本跨度从细胞水平到组织水平和生物系统水平的研究平台。用微电极阵列能无损、快速、长时间胞外同时记录细胞群体的电活动。神经元群体发放模式往往携带有更为丰富和精确信息，有助于对神经元群体编码和信息传递过程进行分析，即在网络水平上研究神经元自发时间和空间活动模式［6］。MEA非常适合用于探测分离培养细胞的网络或系统行为特性。它不仅可以记录单个神经元的响应幅度的事件关联，更重要的是能记录到沿神经元分布的神经冲动的精确时间关联。这种相关性分析，是神经生物学研究中的重要工具。在研究神经元连通性模型时，时间相关分析可以作为功能解剖工具来判断两个神经元是否存在相互作用的互动调节。微电极同时记录分布式神经元活动对于分析神经元电发放的时空模式有指导性作用，可以揭示出神经网络中的精确时间相关特性和放电模式的同步性。因此，分析多位点同时记录的神经元的时空关联，可以探测到沿着皮层网络传播的同步冲动。通过对这种分布式神经元放电的精确时间关联编码的分析，可以提供进一步的线索来理解神经信息处理的机理。MEA为神经信息时空编码的研究提供了有力的研究平台［7］。

    本文在MEA的芯片表面上研究了大鼠嗅觉系统神经细胞的培养方法，制作了嗅球神经网络细胞芯片。通过72通道神经信号接口调理电路和神经信号同步采集系统［8］，获取了微电极阵列芯片上嗅球神经网络的神经电生理信号。文中比较了不同培养时期神经网络的形态及其相应的电生理信号，并初步分析了嗅球神经网络电生理信号的复杂性。这个工作对基于MEA的嗅觉系统的时间编码研究的平台构建做了初步的尝试，并为下步即将开展的基于时间编码和实验验证的嗅觉系统生理建模的研究打下了良好的基础。此外，通过文中大鼠全心离体心电信号采集和海马神经网络自发放信号采集的实验，文中建立的基于MEA的微电极阵列及其神经信号采集分析系统的检测平台可广泛适用于神经细胞电生理和神经生物学的研究。

　　方  法

    微电极阵列检测技术原理和嗅球神经细胞培养

    MEA是在硅或者玻璃基底上采用标准硅工艺，并采用liftoff技术制作的微电极阵列，相对于FET的制作，其工艺较为简单。图1所示的是平面微电极阵列及微电极位点在电镜下的显微图结构。电极可选用金、铱或铂，直径通常在几个微米到几十微米之间。本系统采用的是德国MCS公司生产的200/30iRTiprT型号的微电极阵列芯片，该芯片具有60个检测位点。

    MEA预处理方法如下：亲水处理和高压灭菌处理后，用多聚赖氨酸涂层板，增加神经细胞的贴壁性能。嗅球细胞提取与培养如下［9］：1）取材：新生鼠（孕鼠15～17 d的胚胎）于无菌条件下取脑，剪开颅骨，快速取出完整大脑剥净脑膜，取整个嗅球备用。2）洗涤：用PBS液（pH=7.4，下同）清洗，离心1 000 g×3次，弃上清。3）机械解离：用眼科剪剪成小碎块（0.5 mm3左右）。4）消化：0.25％胰蛋白酶10 mL消化（37 ℃，30 min），每隔10 min均匀振荡，使组织块变成疏松白色小块，用吸管反复吹打成单细胞悬液后，用终止液终止消化过程，用200目筛网过滤。5）清洗：PBS液清洗，离心1 000 g×3次，弃上清。6）培养：用含10 μg/L的DMEM10%FCS制备成单细胞悬液，按3×106个/mL的密度将细胞接种在事先用多聚赖氨酸涂层的MEA上，培养箱中培养2～4 h后贴壁；每3 d换液。本文培养方法是在器件上培养一层细胞，让它们随机地生长，在细胞密度和阵列集成度都较大的情况下，保证一部分栅极上能生长上细胞。

    基于PCI和DSP多通道神经信号刺激信号产生和采集系统

    为了和微电极阵列芯片接口，采集芯片上细胞的动作电位并对芯片上的电极产生刺激信号，信号调理模块要完成两个功能：调理神经信号使其在采集控制模块的ADC输入端得到理想输入信号；调理采集控制模块的DAC输出，产生刺激信号。人体的神经电生理信号幅度一般从几十μV到几百μV，频率的主要成分一般在几个Hz到5 kHz之间。根据神经信号以及神经电极的接口特性，调理电路必须具备高共模抑制比、高输入 阻抗、低噪声和低漂移。

    本文以TI公司的TMS320VC5402和PLX公司的PCI9054为基础，开发设计了一种基于PCI和DSP结构的多通道神经信号采集系统（图2），系统指标如下：1)通道电压噪声：<0.6 μVrms；2)通道数：≤72；3)采样速率：80 KSPS/channel；4)采样分辨率：16位/channel；5)采样模式：并行同步；6) 最高传输速度：12 MB/s。同时，为了对微电极阵列芯片产生刺激信号，该系统提供4通道同步DAC刺激信号的产生，通过通道选择，可以定位到任何一个位点。

    结  果

    检测系统的验证

    为了验证系统的可靠性和可行性，本文设计并进行了以下3个方面的实验。

    1）采用商用Cerebus 128Channel Data Acquisition System (Cyberkinetics Inc.)配备的神经电信号模拟发生器和信号采集系统，对比测试本系统的实验数据。本系统采集的数据波形如图4所示。图4中的上图是长时间采集的模拟信号波形，波形中的梅花波用以模拟低频成分的LFP信号，而中间夹杂的较高频率的尖峰信号用以模拟APs信号，图4中的下图是局部信号的放大，可以明显看到Spike信号叠加在低频场电位信号上。本系统测试结果与Cerebus系统一致。

    2）借鉴国外商用MEA测试系统产品培训的做法，采用离体心脏来测试整体系统的性能。该方法能在合适条件下可肉眼观察离体心脏的搏动，伴随着这种搏动会有同步心电信号的出现。因此，本系统采用新生大鼠全心离体的心电信号采集实验，初步验证微电极阵列以及神经信号采集系统的可行性。具体的实验方法如下:1) 取材：大鼠新生鼠；2) 将新生鼠断头，用眼科剪和眼科镊分离心脏，用37 ℃温浴的台式液灌流，清除血液；3) 迅速将离体心脏置于多通道电极阵列（MEA）上，保持灌流液温度。在这种条件下，小鼠离体心脏可以维持0.5～1 h左右的时间搏动，具体时间视实验情况而异。将离体新生大鼠的整个心脏放在MEA的培养皿中，如图3所示。开启多通道信号采集系统进行离体心电信号的采集，对其中一个通道进行连续采集得到的心电波形如图5中的上图所示。局部放大后其中一个的ECG信号如图5中的下图所示。

    3）海马区神经元网络的培养和测试。由于目前人们将MEA应用于海马区神经网络的研究较为普遍［10］，为了进一步验证本系统的工作性能，我们也记录了培养2周后的海马神经网络的多通道自发放信号(图6)。上图是其中一个通道连续5 s采样记录的实验数据，下图是上图通道局部放大后的海马神经元的Spike信号发放信号，从中可见神经元动作电位几种典型的发放波形，采用叶学松等［11］的分类方法可得到明显的分类效果。多通道同步记录的实验数据见图10。

    嗅球神经细胞在MEA上的培养结果

    细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质，在很大程度上受各种环境因素的影响。而影响动物细胞生长、繁殖的环境因素有很多，主要有温度、pH、营养成分、溶氧及气体环境、渗透压及其它因素等方面。温度是细胞在体外生存的基本条件之一，人和哺乳动物细胞最适宜的温度为37 ℃。细胞代谢强度与温度成正比，偏高于此温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。合适的pH也是细胞生存的必要条件之一，动物细胞合适的pH值一般在7.2～7.4，低于6.8或高于7.6都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同细胞对pH也有不同要求：原代培养细胞对pH变动耐受性差，传代细胞系耐受性较强。对大多数细胞来说，偏酸性环境比碱性环境更利于生长。对MEA进行预处理后，在MEA上培养嗅球神经元若干天后，得到发育较好的神经网络。嗅觉神经芯片的观察和操作系统由Leica DM2500和Eppendorf TransferManNK2构成，如图7所示。培养4 d后的嗅球神经元已出现互相连接，并逐渐形成网络的现象；培养10 d后的嗅球神经网络则更加密集，结果如图8所示。

    嗅球神经细胞网络动作电位的同步检测及活性判断

    我们分别记录了嗅球神经芯片上培养了4 d和10 d后的神经元发放电信号，系统采样频率设置在50 kSPS/channel。60个通道的实验统计表明，培养了4 d的芯片基本上未见明显的神经电活动现象。图9中的上图和下图分别为其中一个通道4 d和10 d后的实验结果。通过比较采集到的不同培养天数的神经元发放信号可以看出，培养10 d后采集到的嗅球神经信号较4 d后采集到的信号在信号发放幅度上有明显的提高。对图10中第4通道神经元的发放进行初步统计，在1.8 s时间内，神经元的发放次数为77个。我们对来自芯片的60个通道的记录信号在时域和频域上进行检测分析和Spike信号的提取。哺乳动物嗅球的神经细胞比较复杂，由僧帽细胞（mitral cell）、簇细胞(tufted cell)、颗粒细胞(granular cell)及球旁细胞(periglomerular cell)等典型细胞构成了嗅球内一整套完整的气味信号传导和调节系统。根据动物嗅球神经细胞电生理仿真模型计算所得的神经细胞放电特性［1213］，本文选取了具有几个较具代表意义的通道信号，如图10所示。 其中具有低频能量分布的1、2通道和具有高频能量分布的3、4通道在频谱的结构上有明显的不同。这些不同的信号特征代表了哺乳动物嗅球系统中复杂的电生理现象。

    根据以上结果，针对不同培养时期的嗅球细胞，可以通过3个方面进行活性的判断。首先光镜观测嗅球网络的形态及其互相连接，并逐渐形成网络的过程，形成直观的判断。其次针对不同培养阶段的状态，通过神经电生理信号的检测并分析其实际的网络电活动特征。例如spike发放的强度以及位置。联合这两个方面的演化过程信息，还可以进一步通过光镜下的细胞操纵来获得时空关系上的活性特点进行判断。最后通过电或者化学气味的刺激来获得嗅觉神经芯片实际的性能。由于其性能与嗅球神经元网络的活性密切相关，显然也可以成为判断活性的重要依据。至于刺激实验方案的设计与实现将会成为未来工作的一个重要方向。

    嗅觉神经芯片的使用

    为了在MEA上得到较为简单的嗅觉系统的神经网络，在接下来的工作中，我们将利用具有相对简单的嗅觉系统的动物并制作相应的嗅觉芯片，使其在空间和形态上具有可分性。此外，我们将控制神经细胞培养的密度以及通过相应的仪器设备控制细胞的生长位点，通过观察神经芯片上细胞的网络结构，相应地获得较为接近实际的网络模型。通过本系统的电刺激信号或化学刺激信号作用于相对的神经位点，研究嗅觉神经系统网络的动力学过程。同时，通过向芯片中加入神经递质受体的拮抗剂，如荷包牡丹碱（bicuculline）、双氢β刺酮酊（DHβE）等，研究这种化学物质对嗅觉系统时空编码的影响。目前我们已经完成了具有简单嗅觉系统（如蝗虫触角）以及完整动物嗅球电生理多室动力学模型的建立。如何将嗅觉系统的仿真模型及编码研究和实际的测量对应将是未来工作的重点。

    结  论

    本文基于MEA构建的嗅觉神经芯片及其测试系统能够成功地获取芯片上不同培养时期嗅球神经网络的神经电生理信号，为分析嗅球神经网络电生理信号的复杂性和嗅觉系统时间编码的研究工作提供了必要的数据以及初步系统平台，从而为下步即将开展的基于时间编码和实验验证的嗅觉系统生理建模的研究打下了良好的基础。同时，本工作建立的基于MEA及其神经信号采集分析系统的检测平台同样可广泛适合于神经细胞电生理和神经生物学的研究。

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