经颅磁刺激对脑梗死大鼠神经功能恢复及神经微丝蛋白表达的影响

　　作者：刘晶，赵合庆，余锋，戴永萍，李向    作者单位：215004苏州大学附属第二医院神经内科

　　【摘要】  目的 研究经颅磁刺激（TMS)对脑梗死大鼠神经功能恢复和神经微丝蛋白(NFP)200表达的影响。方法 SD大鼠60只，采用线栓法制作脑缺血模型，随机分为TMS组与假刺激组（各30只），两组又分为1 d、3 d、7 d、14 d和21 d组（每组6只）。TMS组大鼠给予TMS共200个脉冲，每天2次，按不同时间组持续相应天数。治疗后给两组大鼠进行神经功能缺损评分，采用免疫组化法检测梗死灶周围区域NFP200的光密度值。结果 治疗14 d和21 d时，TMS组的神经功能缺损评分(2.67±0.82，1.50±0.55) 显著低于假刺激组(3.67±0.52，3.17±0.75)（P<0.05, P<0.01）;TMS组大鼠脑梗死灶周围NFP200的光密度值（1.363±0.045，1.581±0.037）显著高于假刺激组(1.290±0.026，1.473±0.037)（均P<0.01）。结论 TMS可以促进脑梗死大鼠神经功能的恢复及脑梗死周围区域NFP200表达上调。

　　【关键词】  经颅磁刺激；脑梗死；神经微丝蛋白

    Effects of transcranial magnetic stimulation on the recovery of neurological function and the expression of neurofilament protein in rats with cerebral infarction  LIU Jing, ZHAO Heqing, YU Feng, et al. Department of Neurology, the Second Affliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China

    Abstract：Objective  To investigate the effects of transcranial magnetic stimulation（TMS）on the recovery of neurological function and the expression of neurofilament protein (NFP)200 in rats with cerebral infarction. Methods  The stringfastening method was used to establish focal ischemiareperfusion models in 60 SpragueDawley rats and the rats were divided into the TMS group and the sham TMS group (composed of 30 rats each). Then each group were divided into the treated 1 d,3 d,7 d,14 d and 21 d subgroups（composed of 6 rats each）. TMS group rats were administered with 2 sessions of TMS (200 pulses total)daily, keeping on corresponding days in different groups. The recovery of neurological function and the optical density of NFP200 by immunohistochemistry in the infarct peripheral zone in two groups were detected after therapy. Results  At the 14 d and 21 d after treatment, neurological deficit scores of TMS group(2.67±0.82,1.50±0.55) were significantly lower than those of the sham TMS group(3.67±0.52,3.17±0.75)（P<0.05, P<0.01）;the optical density of NFP200 in the infarct peripheral zone of TMS group （1.363±0.045,1.581±0.037）  were significantly higher than those of the sham TMS group (1.290±0.026, 1.473±0.037)（all P<0.01）.Conclusion  TMS has some effects of promoting the recovery of neurological function and upregulating the expression of NFP200 of the infarct peripheral zone in cerebral infarction rats.

    Key words：transcranial magnetic stimulation; cerebral infarction;  neurofilament protein

　   经颅磁刺激（TMS）技术是利用一定强度的时变磁场在脑内诱发感应电流，并且此刺激可兴奋组织并影响脑内各种代谢过程和电活动的技术，相对于经颅电刺激具有无痛、无创伤、不衰减、局灶性、操作简便等特点 ［1］。已有研究［2］表明，TMS可促进脑梗死患者神经功能的康复，但其具体作用机制尚未明确。本实验研究TMS对脑梗死大鼠神经功能恢复的作用及对脑梗死灶周围组织神经微丝蛋白（NFP）200表达的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物及分组  健康纯种雄性SD大鼠72只，上海依莱克斯动物实验中心提供，3～4 月龄,质量255～330 g,清洁级。随机分为TMS组（30只）、假刺激组（30只）和正常对照组（6只），前两组又分为治疗1 d、3 d、7 d、14 d和21 d组（每组6只）。

    1.1.2  仪器和试剂  Magllite Compact磁刺激仪（丹麦Dantec公司）；兔抗大鼠NFP200 IgG(1∶400，Chemicon公司)；生物素化山羊抗兔IgG(1∶200，武汉博士德生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  模型制备  给大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(3.5 mg/kg)麻醉，仰卧位固定，麻醉期间用40 W白炽灯照射加温,并用肛表持续监测直肠温度,使之维持在(37±1)℃。参考廖维靖等［3］的改良Zea Longa线栓法在大鼠右大脑中动脉（MCA）插入线栓，阻断120 min后拔除，手术结束待大鼠清醒后，参考Zea Longa的5分制评分标准［4］，通过观察大鼠行为及肢体瘫痪情况进行评分，2分、3分者为合格模型。

    1.2.2  TMS  造模后1 d，将TMS组大鼠固定，C100线圈（ID=15 mm,OD=100 mm）置于大鼠头部上方，线圈内径边缘对准大鼠头部两耳前缘连线（线A）与正中线(线B)交点，即线圈中心位于交点前7.5 mm，线圈中心距大鼠头顶高度2 mm，线圈平面与该两线平面平行，TMS组刺激强度为75%最大输出功率，频率1 Hz。每只大鼠每天给予2串刺激，每串刺激100个脉冲（线圈放电刺激100次），2串刺激之间间隔1 h；按不同时间亚组分别给予相应天数的连续TMS。假刺激组只将大鼠固定，线圈置于大鼠头部上方相同时间，而不给予TMS。

    1.2.3  神经功能缺损评分  在预定时间点，参照Mensura等［5］的标准对两组大鼠行神经功能缺损的综合评分，观察自发性同侧转圈、对侧后肢的复位、平衡木行走能力、双侧前爪抓握。在每个时间点通过以上4个测试，得出总的神经功能缺损评分（最大总分为12分）。

    1.2.4  NFP200阳性纤维检测  各组大鼠在行神经功能缺损评分后（正常组大鼠在实验后1 d），深度麻醉断头取脑，参照George等［6］的大鼠脑立体定向图谱，冠状面切取前囟+1.0～ -1.0 mm部分2 mm厚脑片，采用抗生物素生物素过氧化酶复合物法(ABC法)进行NFP200阳性纤维检测。对照实验：以正常羊血清和PBS代替一抗，同步进行上述免疫组化染色。图像分析:每张大鼠大脑切片在梗死灶周围区域随机选取3个400倍视野, 每一样本随机取3张切片，采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统测定NFP200阳性纤维光密度值,取算术平均值。并以同张片子中的阴性背景,测定其平均光密度值,二者之比即为NFP200阳性纤维光密度值的相对值。

    1.2.5  统计学方法  用SPSS11.5软件对数据进行统计分析。检测结果用均数±标准差(±s)表示，组间比较用独立样本t检验,组内比较采用单因素方差分析。如果差异有统计学意义，进一步用Post Hoc 检验LSD法进行多重比较；两因素间的相关性用双变量相关分析计算其Pearson相关系数。

    2  结  果

    2.1  TMS组与假刺激组大鼠神经功能缺损评分比较  见表1。治疗1 d、3 d、7 d时两组神经功能缺损评分差异无统计学意义；治疗14 d和21 d时，TMS组的神经功能缺损评分显著低于假刺激组（P<0.05，P<0.01）。

    2.2  TMS组与假刺激组NFP200免疫阳性纤维表达比较  光镜下可见正常组大鼠NFP200 阳性纤维在大脑皮质、纹状体、胼胝体、内囊、外囊均匀分布,呈棕色网条状。TMS组与假刺激组治疗1～3 d大鼠脑梗死灶周围区域NFP200阳性纤维平均光密度值较正常组显著降低(均P<0.01)，纤维排列紊乱、减少，染色明显变浅；3 d时最低，7 d时有回升。TMS组治疗7 d、14 d、21 d组NFP200 阳性纤维染色加深，变粗成束，光密度值显著高于假刺激组(均P<0.01)。见表2。

    2.3  NFP200阳性纤维光密度值与神经功能缺损评分的相关性  相关分析显示TMS和假刺激组治疗21 d组大鼠梗死灶周围区域的NFP200 阳性纤维光密度值与神经功能缺损评分呈负相关（r=-0.467, P<0.01）。 表1  TMS组与假刺激组大鼠神经功能缺损评分比较 注：与假刺激组比较*P<0.05，** P<0.01表2  TMS组与假刺激组大鼠脑梗死灶周围区NFP200阳性纤维表达比较注：与正常对照组比较*P<0.01；与假刺激组比较ΔP<0.01

    3  讨  论

    1985年,Barker等［7］利用磁场产生的感生电流对中枢神经系统进行了有效的刺激，这种技术被称为TMS。由于磁刺激能兴奋深部的外周神经组织及大脑和脊髓,并且可以通过调节其频率、强度、刺激间歇及持续时间来影响中枢神经系统的兴奋性,因而对外周及中枢神经系统损伤疾病具有潜在的治疗作用。

    金鑫等［8］用100%峰强度的单脉冲TMS对163例脑梗死患者治疗14 d后，发现TMS组FuglMeyer运动功能（FMA）评分及Barthel指数评分与对照组相比差异有统计学意义,TMS组临床疗效明显优于对照组。Eman等［9］研究显示急性脑梗死患者接受10 d的TMS治疗后其残疾等级评分明显好于对照组。本实验中对大鼠脑缺血后的神经运动功能进行观察，脑缺血大鼠都出现左侧肢体运动功能障碍，瘫痪完全,两组大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义(P>0.05) 。假刺激组大鼠患肢神经运动功能随着时间的延长也逐步有所恢复，1周以后运动功能开始改善,术后第2周明显恢复,以后虽进展缓慢,但仍有提高,说明急性脑梗死后运动功能确实存在着自然恢复的过程,即运动功能有可塑性。同时通过假刺激组与TMS组的对比观察，发现TMS组大鼠的神经运动功能在脑缺血后最初1周与假刺激组并没有显著差别，恢复程度相似，然而在两周后TMS组的神经功能缺损评分明显降低，其运动功能的改善程度优于假刺激组(P<0.05)，并且在21 d时继续保持这一优势(P<0.01)。提示TMS可以促进脑梗死大鼠的神经功能恢复，具有神经保护作用。

    中枢神经系统突触结构和功能的可塑性是神经运动功能恢复的基础。神经元轴突的出芽和再生是神经元在损伤及缺血时发生可塑性变化的重要标志。Hayrannisa等［10］发现大鼠脑缺血再灌注损伤后患肢保留运动诱发电位（MEP）,健肢的MEP潜伏期延长，指出这些现象应该与局部缺血后神经元突触和轴突不同程度恢复有关。NFP是反映神经元和突触功能状况的内在标志物之一，是神经元细胞骨架的主要组成成分,特异性地分布于神经元的胞体及突起内。NFP分别由低相对分子质量(NFP60)、中等相对分子质量(NFP160) 和高相对分子质量(NFP200) 3 种亚单位组成，NFP在维持神经细胞正常形态和轴浆运输方面具有至关重要的作用［11］。NFP200是神经元细胞质的中间丝,与其他的中间丝蛋白无交叉性反应,能特异地对神经元核周体、神经树突及轴突进行染色。因此NFP200常被用于观察缺血性半暗区神经元轴突的形态学变化及相关蛋白的表达,并由此证实神经元轴突的出芽及再生。本实验中采用单克隆NFP200蛋白作为神经轴突的标记物。脑缺血后早期（治疗1 d、3 d）TMS组与假刺激组大鼠梗死灶边缘区NFP200 阳性纤维光密度值较正常组显著减低(均P<0.01)，而两组间差异无统计学意义（均P>0.05）。由于神经元的细胞骨架在维持神经细胞正常形态和轴浆运输方面具有至关重要的作用,因此NFP表达的减少可导致神经元的合成、迁移和细胞内物质转运过程出现障碍,因而无法维持神经系统正常的功能活动。TMS组大鼠经TMS治疗7 d时NFP200 阳性纤维表达水平比假刺激组显著增高(P<0.01)，治疗14 d、21 d时NFP200 阳性纤维表达水平继续升高，仍显著高于假刺激组 (均P<0. 01)；表明TMS治疗通过加快细胞内相关神经因子的合成，增强梗死灶边缘缺血半暗区NFP的活性,促进神经轴突的出芽和再生。提示TMS有助于促进缺血缺氧脑损伤恢复,而促进脑组织神经网络重建是其可能的机制之一。相关分析显示脑缺血大鼠梗死灶周围区的NFP200阳性纤维光密度值与神经功能缺损评分呈负相关，也提示脑缺血后神经功能的恢复与梗死灶周围NFP表达的上调有密切的关系。

【参考文献】  ［1］Yasuo Terao, Yoshikazu Ugawa. Basic mechanisms of TMS［J］. J Clin Neurophysiol，2002,19:322.

［2］Paulo SB,AlonsoAlonso M,Carlos GM,et al.Hand function improvement with lowfrequency repetitive transcranial magnetic stimulation of the unaffected hemisphere in a severe case of stroke［J］. Am J Physical Med Rehabilit,2006,85:927.

［3］廖维靖,刘淑红,范明,等.线栓阻断大鼠大脑中动脉制作缺血性脑损伤模型的改良［J］.中华物理医学与康复杂志,2002,24:345.

［4］Zea Longa E,Winstein PR,Carlson S,et a1.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke,1989,20:84.

［5］Mensura A,James P,Marc R.Intracerebral hemorrhage in the rat effects of hematoma aspiration［J］.Stroke,1998,29:1917.

［6］George P,Charles W,诸葛启钏.大鼠脑立体定位图谱［M］.第1版.北京:人民卫生出版社,2005.58～60.

［7］Barker AT, Jalinous R, Freeston IL. Noninvasive magnetic stimulation of the human motor cortex［J］. Lancet， 1985,1:1106.

［8］金鑫,吴小未,王俊芳,等.经颅磁刺激在脑梗死患者运动功能康复中的效果［J］.中华医学杂志,2002,82:534.

［9］Eman MK,Mohamed AA,Nehal F,et al. Therapeutic trial of repetitive transcranial magnetic stimulation after acute ischemic stroke［J］. Neurology ,2005,65:466.

［10］Hayrannisa B,GursoyOzdemir Y,Unal I,et al.Altered mechanisms of motorevoked potential generation after transient focal cerebral ischemia in the rat:implications for transcranial magnetic stimulation［J］. Brain Research,2000, 873:26.

［11］LoPachin RM,He D,Reid ML,et al.2,5Hexanedioneinduced changes in the neurofilament subunit pools of rat peripheral nerve［J］. Neuro Toxicology, 2005, 26:229.