脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因转录表达的研

作者：裴傲,张亚卓,万伟庆,孙梅

作者单位：首都医科大学北京市神经外科研究所， 北京 100050           【摘要】  　　目的　 检测脑胶质瘤中hMLH1、hMSH2基因mRNA表达水平，探讨其在胶质瘤发病过程中的作用。 方法　 用半定量RT-PCR法检测42例脑胶质瘤和5例正常脑组织标本中hMLH1、hMSH2基因mRNA的表达情况。 结果　 hMLH1，hMSH2 mRNA在正常脑组织中均有表达。在胶质瘤组织中，表达量均低于正常脑组织；hMLH1 mRNA表达缺失3例 （7.1%），hMSH2 mRNA表达缺失7例 （16.7%）；hMSH2转录表达下降与病理分级相关。 结论　 hMLH1、hMSH2基因在脑胶质瘤中转录表达下降，可能与胶质瘤发病相关。

【关键词】  神经胶质瘤； 错配修复基因； 转录表达

    Transcriptional expression of genes hMLH1 and hMSH2 in glioma

    PEI Ao, ZHANG Yazhuo, WAN Weiqing, et al

    Beijing Neurosurgical Institute, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China

    Abstract:　 Objective  To investigate into transcriptional expressions of hMLH1 and hMSH2 in glioma, and analyze the relationship between the etiology of glioma and mismatch repair gene.  Methods  Transcriptional expressions of the hMLH1, hMSH2 mRNA were examined in 42 glioma tissues and 5 normal cerebral tissues by semi-quantitative RT-PCR.  Results  hMLH1 and hMSH2 mRNA was all expressed in 5 normal cerebral tissues, while hMLH1 mRNA was not expressed in 3 cases (7.1%) of glioma and hMLH2 was not expressed in 7 (16.7%). Moreover, expression levels of hMLH1 and hMSH2 were significantly lower in glioma than in normal tissues, and hMSH2 mRNA express decreasing was correlated with the pathologic grade.  Conclusion  Low transcriptional expressions of hMLH1 and hMSH2 exist in glioma, which may correlate with the occurrence of glioma.

    Key words:　 glioma;  DNA mismatch repair gene;  transcriptional expression          脑胶质瘤是常见的颅内原发性肿瘤，但其发病机制尚不明确，目前认为与多种基因的异常有关。近年来发现：DNA错配修复 （mismatch repair，MMR） 基因与多种肿瘤的发生相关，有研究证实脑胶质瘤的发生亦与MMR功能缺陷有关[1]。本研究应用半定量RT-PCR法，检测2004年1月～12月间北京天坛医院神经外科手术切除的脑胶质瘤标本中的hMLH1和hMSH2基因mRNA的表达情况，从转录水平探讨MMR基因与胶质瘤发生的关系。

    1    材料与方法

    1.1    材料    42例胶质瘤标本中，男20例，女22例；年龄3～71岁，平均37.6岁。术前均未行放疗或化疗。按WHO中枢神经系统肿瘤分类标准，星形细胞瘤11例，少枝胶质细胞瘤4例，少枝－星形细胞瘤12例，室管膜瘤5例，胶质母细胞瘤10例；Ⅰ～Ⅱ级25例，Ⅲ～Ⅳ级17例。5例正常脑组织标本取自同期脑外伤、脑皮质造瘘病例。标本切除后30 min内分块置于液氮罐内冷冻贮存。

    1.2    方法

    1.2.1    总RNA的提取：    采用Trizol一步法从冷冻组织中提取总RNA，行琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度仪检测RNA纯度。

    1.2.2    mRNA反转录成cDNA：    取总RNA 1 μg，加入Oligo （dT）15 0.4 μl，再加入焦碳酸二乙酯 （DEPC） 处理的无菌纯水至20 μl，70 ℃ 10 min，迅速插入冰浴中冷却；加入5 × 反应缓冲液6 μl，dNTPs （2.5 mmol/L） 2 μl，RNasin 20 U，充分混匀；加入莫洛尼鼠白血病病毒 （M-MLV） 反转录酶 （Promega公司，USA） 200 U，37 ℃孵育1 h；70 ℃ 1 min灭活反转录酶。cDNA样品于－20 ℃保存备用。

    1.2.3    PCR扩增：    引物序列由北京奥科生物技术有限责任公司合成 （表1），以β-actin作为内参照。PCR反应体系为20 μl，以无菌纯水代替DNA模板作为阴性对照。PCR反应混合物包括：10 × PCR缓冲液2 μl， dNTPs （2.5 mmol/L） 1 μl，MgCl2 （25 mmol/L） 1.5 μl，上、下游引物 （10 μmol/L） 各0.5 μl，DNA模板1 μl，Taq酶1 U，加无菌纯水至20 μl，加石蜡油2滴。PCR反应过程：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

    1.2.4    结果分析：    用1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，在Kodak凝胶成像分析系统上测量每一条带的积分光密度 （IOD），每个条带测3次，取平均值。计算目的条带与内参照条带的IOD比值，作为反映转录水平的标准。

    1.3    统计学方法    用SPSS10.0统计软件对结果进行分析，各组间数值的比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

    2    结    果 （表2）

    琼脂糖凝胶电泳结果见图1。在5例正常脑组织中，hMLH1、hMSH2 mRNA均有表达，IOD比值分别为0.723 ± 0.036和0.707 ± 0.061。在42例胶质瘤组织中hMLH1 mRNA表达缺失3例 （7.1%），分别为星形细胞瘤 （Ⅱ级）、少枝-星形细胞瘤 （Ⅲ级） 和胶质母细胞瘤 （Ⅳ级）；IOD比值为0.479 ± 0.259。hMSH2 mRNA表达缺失7例 （16.7%），分别为胶质母细胞瘤 （Ⅳ级） 5例，星形细胞瘤 （Ⅱ级） 1例，少枝-星形细胞瘤 （Ⅱ级） 1例；IOD比值为0.360 ± 0.218。与正常脑组织相比，hMLH1、hMSH2 mRNA表达差异均有统计学意义 （独立样本t检验，P < 0.05）。

    经统计学分析，hMLH1 mRNA表达下降在不同性别间 （独立样本t检验，P = 0.682），各年龄组间 （单因素方差分析，P = 0.892），各病理类型间 （单因素方差分析，P = 0.963） 和不同病理分级间 （独立样本t检验，P = 0.635） 的差异均无统计学意义。hMSH2 mRNA表达下降在不同性别间 （独立样本t检验，P = 0.511），各年龄组间 （单因素方差分析，P = 0.965） 差异无统计学意义；各病理类型组间相互比较，hMSH2 mRNA在胶质母细胞瘤中的表达较少枝胶质细胞瘤和室管膜瘤低差异有统计学意义 （单因素方差分析，P < 0.05），而其他类型胶质瘤之间差异无统计学意义 （P > 0.05）；在高级别 （Ⅲ~Ⅳ级） 胶质瘤中，hMSH2 mRNA表达下降较低级别 （Ⅰ~Ⅱ级） 胶质瘤明显，差异有统计学意义 （独立样本t检验，P < 0.05）。

 3    讨    论

    　       MMR基因是近十余年来才被发现的基因，存在于原核生物、真核生物以及人体内，目前已发现的人类MMR基因主要有hMLH1、hMLH2等9种。其通过编码不同的MMR蛋白，特异性识别、切除并修复错配碱基，保持遗传物质的稳定性，避免基因突变的发生。当MMR基因发生异常时，无法修正DNA复制、合成过程中出现的碱基错误，造成细胞的突变率增加，产生遗传不稳定性，引起细胞恶性转化[2]。现已明确，MMR基因异常是遗传性非息肉病性结直肠癌 （HNPCC） 的发病原因。此外，已发现在胃癌、肝癌、肺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤中均存在MMR系统的异常[3]。

    对胶质瘤与MMR基因的研究尚少，且多限于蛋白表达水平。林瑜等[4]报道，在37例胶质瘤中有10例hMLH1或hMSH2 （同属人类DNA错配修复基因） 蛋白表达异常，且均为微卫星不稳定性 （microsatelite instability，MSI） 阳性。本研究采用半定量RT-PCR法检测了hMLH1和hMSH2基因mRNA在脑胶质瘤中的表达情况，发现在正常脑组织中hMLH1和hMSH2 mRNA均有表达；在42例脑胶质瘤中，3例hMLH1 mRNA表达缺失，39例表达下降，与正常脑组织差异有统计学意义。经统计学分析，hMLH1 mRNA表达下降与病人性别、年龄、病理类型和级别无关，提示在胶质瘤发生的早期即存在hMLH1转录表达的下降，进而造成蛋白表达异常，导致错配修复功能缺陷。

    本研究发现：在42例脑胶质瘤中，7例hMSH2 mRNA表达缺失，35例mRNA表达下降，与正常脑组织差异有统计学意义。经统计学分析，hMSH2 mRNA表达下降与病人性别、年龄无关；在高级别的胶质瘤中mRNA表达下降更加明显。同样，高级别的胶质母细胞瘤与相对低级别的少枝胶质细胞瘤和室管膜瘤比较，前者mRNA表达下降明显高于后者。这说明在胶质瘤中存在hMSH2基因转录表达异常，且胶质瘤恶性程度越高，转录下降程度越明显。彭志强等[5]用免疫组化法研究hMSH2蛋白在星形细胞瘤中的表达，发现在低级别和高级别星形细胞瘤中，蛋白表达的缺失率分别为33.3%和65.2%，蛋白缺失率与星形细胞瘤的恶性程度密切相关；本实验结果与此相符。

    本研究结果表明：脑胶质瘤中hMLH1和hMSH2 的转录水平均下降，与Wei等[6]的报道一致，他们发现：在33例胶质瘤中，7例 （21.2%） hMLH1表达水平降低，14例 （42.4%） hMSH2表达水平降低，6例 （18.1%） hPMS2 （同属人类DNA错配修复基因） 表达水平降低。在低级别的胶质瘤中即已出现hMLH1转录水平降低，提示其可能与胶质瘤的发生有关联；而hMSH2转录水平下降与胶质瘤的分化程度相关，提示其可能与胶质瘤的发展有关联。

【参考文献】  [1] LEUNG S Y, YUEN S T, CHAN T L, et al. Chromosomal instablity and p53 inactivation are required for genesis of glioblastoma but not for colorectal cancer in patients with germline mismatch repair gene mutation [J]. Oncogen, 2000, 19(35): 4079-4083.

[2] PELTOMAKI P. Deficient DNA mismatch repair: a common etiologic factor for colon cancer [J]. Hum Mol Genet, 2001, 10(7): 735-740.

[3] WANG Y C, LU Y P, TSENG R C, et al. Inactivation of hMLH1 and hMSH2 by promoter methylation in primary non-small cell lung tumors and matched sputum samples [J]. J Clin Invest, 2003, 111(6): 887-895.

[4] 林瑜, 杨树源, 周阅昌, 等. 脑肿瘤微卫星不稳定性和错配修复基因hMLH1、hMSH2蛋白表达的改变 [J]. 中华神经外科杂志, 2000, 16(6): 348-352.

[5] 彭志强, 陆永建, 何永垣, 等. 星形细胞瘤中错配修复基因hMSH2蛋白表达的改变 [J]. 中国微侵袭神经外科杂志, 2004, 9(8): 364-365.

[6] WEI Q, BONDY M L, MAO L, et al. Reduced expression of mismatch repair gene measured by multiple reverse transcription-polymerase chain reaction in human gliomas [J]. Cancer Res, 1997,