二烯丙基三硫化物对人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH生长的抑制作用

抗肿瘤药物治疗是神经母细胞瘤(NB)综合治疗的重要部分,但部分患儿对常用的化疗药物不敏感,甚至表现为多药耐药.前期研究表明大蒜素对裸鼠人NB皮下移植瘤有明显的抑制作用川,二烯丙基三硫化物(DATS)是大蒜素中主要的抗肿瘤成分,本研究旨在观察DATS对体外NB细胞生长的影响.　　材料与方法　　1.材料:人NB细胞株SK-N-SH由国家重点学科中山大学普通外科实验室传代保种.DATS(DEF医药化工服务公司),小鼠抗人血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间载附分子一1(ICAM-1)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和TrizolRNA提取试剂盒(Inritrogen公司,USA),Bio-Rad450酶标仪(Coulter公司,USA),流式细胞仪(Coul.ter公司,USA),VEGF和ICAM-1引物和探针由上海博亚生物公司合成.　　2.细胞培养及形态观察:SK-N-SH细胞株常规复苏、传代,高糖DMEM培养基和10%胎牛血清,在370C,5%COZ条件下培养.取对数生长期细胞,制备单细胞悬液,调整细胞浓度为5x10'/L接种于6孔板,每孔接种1ml,培养24h后加人DATS,使其终质量浓度分别为10,20,40,400}.g/L,对照组仅加人培养液;;6孔板置于37`}C,5%COQ培养箱内分别培养24,48,72h,倒置相差显微镜下观察细胞生长及RATS对细胞增殖和形态的影响.　　3.流式细胞仪(FCM)测定DATS对肿瘤细胞凋亡的影响:SK-N-SH以1x109/L接种于培养瓶,待细胞贴壁良好,处于对数生长期时,弃去原培养液,加人无血清高糖DMEM培养液,培养24h;加人不同浓度DATS,分为DATSI、II,}I组,使其终质量浓度分别为10,20,40},g/L,培养24,48h;0.25%胰酶消化,制成单细胞悬液,调整细胞密度为1x109/L,缓慢加人70%(一200C)乙醇固定,制成单细胞悬液,4℃过夜;采用碘化丙锭(PI)一步插人法,将等体积的细胞悬液和PI染液混合.测定前将样品用300目尼龙膜过滤,将样品加人FCM的样品室,上机测定细胞凋亡.　　4.荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测SK-N-SH细胞VEGF和ICAM-1mRNA表达的影响:SK-N-SH细胞以1x10"个接种于培养瓶,细胞贴壁良好,处于对数生长期时,弃去原培养液,加人DATS,使其终质量浓度分别为10,40},g/L,设空白对照组,置于370C,5%COZ培养箱内培养72h.取细胞培养上清液备ELISA测定.　　细胞刮子收集细胞,按TrizolRNA提取试剂盒说明提取RNA.引物和探针:VEGF'上游引物为5'-GCGAGGC-CACGGCTTAT-3',下游引物5'-TGAG'1TGAGGTTGGC-CTGTTC-3';ICAM-1上游引物为5'-TGCTGCCTATT-GGGTATGC-3',下游引物为5'-GGCC'I"}'TGTGT'I"EI'-GATGCTA-3';GAPDH上游引物为5'-GAAGGT-GAAGGTCGGAGTC-3',下游引物为5'-GAAGATGGT-GATGGGATTTC-3';VEGF探针为5'-FAM-AAG-CAAAGATCTGGAGGAGCAGT-TAMARA-3’;ICAM一1探针为5'-FAM-CTTACAGAAGAAGTGGCCC'TCCATA-TAMARA-3';GAPDH探针为5'-FAM-CAAGC'TTC-CC('>TTCTCAGCC-3'.逆转录反应条件:93℃3min预变性,以930C30s,600C30s,720C45s为I个循环;共35个循环后72℃延伸10min.反应后取8闪PCR扩‘增产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳.阳性定量模板甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)按倍比稀释而成.扩一增反应条件为:93℃2min,930C30s,600C1min;共40个循环.　　5.EL,ISA法测定SK-N-SH细胞培养上清液中VEGF,ICAM-I浓度:将收集的细胞培养上清液,低温4000r/min离心5min,收集上清液放人一70℃超低温冰箱保存待测,按ELISA试剂盒操作流程测定VEGF,ICAM-1浓度.　　6.统计学方法:数据用均数士标准差表示,采用,检验和方差分析;计一数资料采用X检验.应用SPSS10.0统计软件分析.　　结果　　I.倒置相差显微镜下SK-N-SH细胞形态变化:UATS作用24h后,SK-N-SH细胞大小、形态和贴壁能力较对照组有明显差异:低浓度DA'I'S组(10,20},扩L)作用后,细胞形态变化不大,贴壁尚可;较高浓度RATS组(40},g/L)作用后,细胞明显皱缩,突起少见,细胞间隙增大,细胞内颗粒颜色加深,折光性增强,大量细胞呈片状脱落,培养液中有多量细胞漂浮,细胞生长明显减缓.处理48h后上述变化更加明显.400},彭LDATS作用24h后,绝大部分肿瘤细胞死亡.　　2.DATS对SK-N-SH细胞凋亡的影响:FCM检测显示3种不同浓度的RATS作用24,48h后,与对照组比较,细胞凋亡率升高,并呈剂量依赖关系,组间差异有统计一学意义(P<0.05,表1).　　3.DATS对SK-N-SH细胞VEGFmRNA和ICAM-1mRNA表达的影响:与对照组比较,不同剂量的DATS能明显抑制SK-N-SH细胞VEGFmRNA和ICAM-1mRNA的表达,与对照组比较,差异有统计一学意义(P<0.05);小剂量组与大剂量组间比较,差异有统计学意义(P<0.05,表2)〕4.DATS对SK-N-SH细胞培养上清液VEGEICAM-1蛋自表达的影响:与对照组比较,不同剂量的DATS均明显抑制SK-N-SH细胞VEGE和ICAM-1的分泌,差异有统计学意义,不同浓度组间比较差异有统计学意义(P<0.05,表2).　　讨论　　NB为儿童颅外最常见的恶性肿瘤,占儿童恶性肿瘤的8%一12%,早期无症状,就诊时常为中、晚期强烈化疗、积极的外科手术和放疗等综合治疗有助于提高患儿的生存率,但总体治疗效果仍不满意,长期生存率仅40%.在目前的化疗、手术、维甲酸等联合治疗外,我们应积极寻找更为有效的治疗方一法和药物.　　近年来国内外的流行病学调查和研究表明,大蒜素具有降低肿瘤发生和抗肿瘤的作用.我们的前期工作已经证实大蒜素对裸鼠人NB皮下移植瘤有明显的抑制作用,作用靶点为抑制肿瘤VEGF的表达.　　DATS是大蒜素中抗肿瘤作用最强的丙烯基硫化物,对多种恶性肿瘤有抑制作用.本研究结果显示,DATS在IO一20},剔L浓度作用于SK-N-SH细胞,光镜下细胞形态变化不大,40},剔L时即可明显抑制SK-N-SH细胞增殖,400扩L则能直接杀灭SK-N-SH细胞.FCM检测进一步证实,10一40},州L的DATS能够诱导SK-N-SH细胞凋亡,并呈剂量一效应关系.　　肿瘤的发生、转移与多种细胞因子有关,ICAM-1是体内重要的细胞活性分子淋巴细胞功能相关抗原一1的主要配体,涉及细胞分化、黍占附及迁移,不仅参一与了机体免疫过程及炎性反应,而且还通过与其相应配体的结合,介导肿瘤细胞与不同细胞、基质的载附,最终使癌细胞逃避免疫监视,利于侵袭转移〔7〕.细胞表面ICAM-1可脱落进入血循环,成为可溶性ICAM-I(sICAM-1)osICAM-1可增强肿瘤细胞与细胞外基质的薪附作用,具有抑制自然杀伤细胞及细胞毒T细胞的细胞杀伤作用,使肿瘤细胞得以逃避机体的免疫监视.ICAM-1与多种恶性肿瘤患者的恶性增殖和转移有关一7-A].本研究结果显示,在体外实验中,DATS能有效抑制SK-N-SH细胞的ICAM-1mRNA的转录和翻译,这种抑制作用呈剂量一效应关系.　　VEGF是多种恶性肿瘤复发和转移的分子标志物,NB肿瘤组织的VEGFmRNA呈高表达,肿瘤组织表达VEGF的高低与肿瘤生长、分级、血管生成有关f}J,高危的1VB患儿常伴有血浆VEGF的高表达’o}.我们前期的研究表明,在体试验中大蒜素能够抑制裸鼠皮下移植瘤VEGFmRNA的转录,降低裸鼠血浆VEGF浓度.进一步的实验表明,大蒜素成分中抑制肿瘤作用最强的DATS体外能够抑制SK-N-SH细胞VEGFmRNA的转录和翻译.　　本研究结果表明,DATS对人NB细胞株SK-N-SH的细胞生物学的作用和影响基因表达的作用是多靶点的,而且是在不同水平上影响SK-N-SH细胞的增殖.D.AST诱导SK-N-SH细胞凋亡的机制及影响细胞VEGF,ICAM-1基因调控的方式,尚有待进一步研究.　　参考文献　　曾纪晓,孙俊杰,莫家骢. 大蒜素对神经母细胞瘤生长的抑制作用[J].中山大学学报(医学科学版),2009,(3):259-263.doi:10.3321/j.issn:1672-3554.2009.03.005.　　Mullassery D,Dominici C,Jesudason EC. Neuroblastoma:contemporary management[J].Arch Dis Child Educ Pract Ed,2009.177-185.　　Donfrancesco A,De loris MA,McDowell HP. Gefitinib in combination with oral topotecan and cyclophosphamide in resistant/relapsed neuroblastoma:pharmacological rationale and clinical response[J].Pediatric Blood & Cancer,2010.55-61.　　Malki A,El-Saadani M,Sultan AS. Garlic constituent diallyl trisulfide induced apoptosis in MCF7 human breast cancer cells[J].Cancer Biology and Therapy,2009.2175-2185.　　Stan SD,Singh SV. Transcriptional repression and inhibition of nuclear translocation of androgen receptor by diallyl trisulfide in human prostate cancer cells[J].Clinical Cancer Research,2009.4895-4903.　　Wang YB,Qin J,Zheng XY. Diallyl trisulfide induces Bcl-2 and caspase-3-dependent apoptosis via downregulation of Akt phosphorylation in human T24 bladder cancer cells[J].Phytomedicine:International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology,2010.363-368.　　Blaheta RA,Powerski M,Hudak L. Tumor-endothelium cross talk blocks recruitment of neutrophils to endothelial cells:a novel mechanism of endothelial cell anergy[J].Neoplasia,2009.1054-1063.　　Roland CL,Dineen SP,Toombs JE. Tumor-derived intercellular adhesion molecule-1 mediates tumor-associated leukocyte infiltration in orthotopic pancreatic xenografts[J].Experimental Biology and Medicine(Maywood),2010.263-270.　　Kaneko S,Ishibashi M,Kaneko M. Vascular endothelial growth factor expression is closely related to irinotecan-mediated inhibition of tumor growth and angiogenesis in neuroblastomas[J].Cancer Science,2008.1209-1217.　　Schiavetti A,Foco M,Chiriacó D. Venous thrombosis and procoagulant factors in high-risk neuroblastoma[J].Journal of Pediatric Hematology Oncology,2010.93-96.