肝脏胰岛素抵抗诱发胆结石形成的研究

研究证实,胆结石的形成与代谢综合征密切相关,包括胰岛素抵抗、向心性肥胖、不同程度的糖耐量降低、月干脂肪变性以及升高的心血管病风险fi-zJ胰岛素抵抗在代谢综合征的发病过程中发挥重要作用,但是关于它和胆结石形成的关系尚不清楚.我们使用肝胰岛素受体敲除的C57小鼠作为研究对象〔3],探讨在高脂饮食以及正常饮食条件下其体内胆结石形成与正常小鼠的比较及其有利胆结石形成的机制.　　材料与方法　　1.材料:肝胰岛素受体敲除的C57小鼠,简称模型鼠,由南京大学模式动物中心提供,SPF级,雄性,体质量18}22g;C57小鼠,由中国科学院上海实验动物中心提供,许可证号:SCXK(沪)2007-OO05,SPF级,雄性,体质量18一22g.胰岛素注射液,江苏万邦生化,批号:110104;Trizol;Invitrogen公司生产,批号:101109;RIPA裂解液,碧云天生物技术研究所,批号:110122;法尼醋衍生物X受体(FXR)山羊抗小鼠一抗以及兔抗山羊二抗均购自美国SantaCruz公司;SYBRGreen,北京天根生物科技有限公司,批号:1102013.增强化学发光(ECL)发光液,碧云天生物技术研究所,批号:100903;胆酸及胆固醇检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,批号:20111003oRoche-LightCycler480荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)仪,瑞士罗氏公司生产;BioradWesternblot系统,美国伯乐公司生产;酶标仪,赛默飞世尔公司生产.　　2.高脂饮食对小鼠胆结石形成的影响:取模型鼠以及普通C57小鼠各20只,分为4组,分别于模型小鼠中的10只皮下注射胰岛素1IU/d,另10只小鼠注射等容量蒸馏水,而对照组小鼠做相同处理.所有小鼠使用致结石饮食(0.5%胆酸,1%胆固醇,15%脂肪乳)饲养3周,在第3周时将各组小鼠处死,检查各组产生结石的例数.判断结石的标准为肉眼观察到胆汁内成形粗大颗粒,并在光镜下见到致密大团块胆固醇结晶.　　3.两组小鼠在正常饮食条件下体内胆汁酸的形成以及胆汁酸相关合成基因的表达:分别取正常小鼠及模型小鼠10只,收集小鼠粪便,检测粪便胆汁酸的分泌.同时,取各鼠肝组织100mg,加Trizol提取RNA,经逆转录成cDNA后使用SYBRGreen在FQ-PCR仪上进行检测,结果以其循环数Ct值进行进行统计,分别检测胆汁酸合成途径中的酶如胆固醇7-轻化酶(Cyp7a1)、固醇12a经化酶(Cyp8b1、胆固醇7a经化酶(Cyp7bl)和胆固醇27a轻化酶(Cyp27a1)的mRNA表达,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参,计算时以对照组相关基因的相对表达量为1同时,使用相同方法检测模型小鼠FXRmRNA的表达,并取同样组织使用RIPA裂解液裂解后将蛋白样品煮沸,使用加样缓冲液经聚丙烯凝胶酞胺电泳分离,然后转膜,封闭,经孵育一抗和二抗以后,使用ECL发光液显色,检测小鼠FXR蛋自的表达,结果使用GEL软件进行扫描灰度值处理,以GAPDH作为内参.　　4.两组小鼠在正常饮食条件下胆同醇含量及其相关因素:分别取正常小鼠及模型小鼠10只,收集小鼠肝脏和胆汁,检测肝脏胆固醇的浓度,并检测胆汁总胆固醇浓度,通过Cgrey表计算胆汁胆固醇饱和指数(CSI).并使用上述方法取肝组织检测胆固醇转运体三磷酸腺昔结合盒转运体GS(AbcgS和Abcg8的mRNA和蛋白表达.　　5.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件分析,计量资料采用均数士标准差(x士、)表示,组间比较采用方差分析及t检验,计数资料以百分率表示,组间比较采用了检验,统计检验采用双侧检验.　　结果　　模型小鼠在使用致结石饲料饲养3周后,有83%产生结石,表明具有肝胰岛素抵抗的小鼠容易形成结石,而注射胰岛素以后,正常小鼠及模型小鼠的结石产生率均有增高,模型小鼠达到了100%,表明加重了胰岛素抵抗,加速了胆结石的形成.结果如图1所示.　　模型小鼠的胆汁酸分泌与正常小鼠比较显著减少(P<0.05),而胆汁酸合成途径中的酶如Cyp7a1,Cyp8bl,Cyp7bl和Cyp27a1mRNA的表达分别降低了30%一80%r与此一致的是,通过检测粪便胆汁酸分泌,表明胆汁酸分泌降低了40%(P<0.05).同时,对这些酶进行调控的FXR的蛋白表达与mRNA表达也显著减少(P<0.05,图2).表明肝脏胰岛素抵抗小鼠通过降低FXR而降低胆汁酸的分泌,减少对结石的消化.　　模型小鼠的肝胆固醇浓度和csl与正常小鼠比较显著升高(P<0.05),其AbcgS和Abcg8的mRNA和蛋白表达与正常小鼠比较也显著升高(P<0.05,图3),这表明肝胰岛素抵抗小鼠通过AbcgS和Abcg8增加了胆固醇的转运,加速了结石的形成.　　讨论　　胰岛素抵抗与胆结石的形成密切相关已经得到了公认,糖尿患者的胆结石发病率达到了30%以上,而正常人的胆结石发病率仅为10%左右[[4].胰岛素抵抗的定义为胰岛素作用的靶器官或组织如肝脏等对胰岛素的敏感性降低而产生的一系列病理生理变化,包括高胰岛素血症、糖代谢异常以及高脂血症等症状.　　本次研究我们选用肝脏胰岛素敲除的小鼠作为胰岛素抵抗模型,在最大程度上模拟了肝脏的胰岛素抵抗,具有其他胰岛素抵抗模型无可比拟的优势,其有效性以及准确性在之前的研究中已经得到了证实.从本次研究的结果可以看出,在使用致结石的饮食后,模型小鼠在3周的时间里结石的发生率达到了正常小鼠的8倍,表明肝脏胰岛素抵抗可以显著加速胆结石的形成而在同时,我们分别在正常小鼠以及模型小鼠注射胰岛素,以造成高胰岛素血症,同样使得胆结石发生率达到了正常小鼠的6倍和9倍,这从另一方面证实了肝脏胰岛素抵抗对胆结石形成的促进作用.　　关于胰岛素抵抗导致胆结石形成的原因众说纷纭,均只停留在现象的观察阶段,对其具体的作用机制以及作用靶点并不清楚.本次的结果表明,肝脏胰岛素抵抗主要是通过两个方面产生胆结石作用,一是肝脏出现胰岛素抵抗以后,胆固醇转运体AbcgS和Abcg8的表达急剧升高,使肝组织的胆固醇含量也显著增加,因此胰岛素抵抗小鼠产生了胆结石;另一方面,在肝脏出现胰岛素抵抗以后,FXR表达大大减少,使得其调控的胆酸合成过程中的重要酶如Cyp7a1,CypBbl,Cyp7b1和Cyp27a1的表达量也下降了30%一80070,并使得粪便胆汁酸的分泌急剧下降,从而减少了对结石的消化.FXR是一类细胞核激素受体,在调节胆汁酸合成、转运和代谢中发挥着重要的作用,具有抗结石形成的作用一}J胆汁酸是体内胆固醇代谢的主要途径,体内合成胆汁酸的经典通路是由Cyp7a1启动,Cyp8b1也参与丁胆酸的合成.线粒体Cyp27a1催化了胆固醇侧链的氧化,其中Cyp7al和Cyp8b1都受FXR的调控.FXR调控Cyp7al和CypBbl主要是通过诱导小分子异源二聚体伴侣(SHP)抑制实现的,SHP通过抑制反式激活的肝受体同源物一1(LRH-1)活以抑制Cyp7al的转录,还可以与肝细胞核因子4(HNF4Q)相互作用抑制Cyp7a1和Cyp8b1的转录甲.绝大部分胆汁酸在经过肠肝循环被重吸收,只有约5%经粪便排出,可以认为粪胆汁酸量与胆汁酸的合成量基本一致,因此我们检测了粪胆汁酸的含量来反映胆汁酸在肝脏合成的速度.本研究结果显示,模型小鼠的FXR表达减少了1倍左右,而Cyp7al,Cyp8bl,Cyp7b1和Cyp27al的表达量也下降了30%一80%,粪便胆汁酸的分泌由正常小鼠的14.9}.,mol/g减少到9.2}A,mol/g,从而减少了胆结石的消化.胆汁胆固醇的分泌主要受异源二聚的胆固醇转运体AbcgS和Abcg8调节,AbcgS和Abcg8水平升高,其转运至胆汁的胆固醇就越多,而过高的胆固醇则引起结石〔s.在胆结石患者体内,AbcgS和Abcg8的表达量分别为正常人的2.8倍和1.9倍,显示出他们在胆结石发展过程中的重要作用,他们的过度表达引起在胆囊中胆汁处于过饱和状态,使得胆固醇结晶以及结石的形成加速.而AbcgS和Abcg8的致结石作用是由胰岛素引起的,与FXR无关.本研究结果显示,模型小鼠的Abc蜘和Abcg8的表达升高近2倍,肝组织的胆固醇含量也达到了2.2m剔g,而正常小鼠含量仅为1.2mg,这表明肝胰岛素抵抗小鼠通过作用于AbcgS和Abcg8产生致结石作用二肝胰岛素抵抗是一个整体的病变包括对脂代谢、糖代谢等都会有影响,其中与胆结石之间的关系还有待进一步研究.　　本研究结果表明,肝脏胰岛素抵抗小鼠可以通过降低FXR以及Cyp7al,CypBbl,Cyp7b1和Cyp27a1的表达,减少胆汁酸的分泌以及升高AbcgS和Abcg8,增加胆汁胆固醇的浓度,加速了结石的形成.　　参考文献　　谢振玮,王伟,艾开兴. 人两种胆囊结石的胆汁差异蛋白质组学研究[J].中华实验外科杂志,2011,(6):935-937.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2011.06.036.　　Ata N,Kucukazman M,Yavuz B. The metabolic syndrome is associated with complicated gallstone disease[J].Canadian Journal of Gastroenterology,2011.274-278.　　陈永生,田雨,吴硕东. C57 BL/6小鼠胆囊胆固醇结石模型的建立[J].中华实验外科杂志,2012.2257-2257.　　Attili AF. Diabetes and gallstones[J].Digestive and Liver Disease,2011.672-677.　　Kitamura T,Kahn CR,Accili D. Insulin receptor knockout mice[J].Annu Rev Physio1,2003.313-332.　　缪辉来,林木生,张利强. 加味大柴胡汤对阻塞性黄疽大鼠胆汁酸代谢的影响及机制[J].中华实验外科杂志,2006,(8):934-936.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.08.012.　　Cai SY,He H,Nguyen T. Retinoic acid represses CYP7A1 expression in human hepatocytes and HepG2 cells by FXR/RXR-dependent and independent mechanisms[J].Journal of Lipid Research,2010,(8):2265-2274.　　王勇,韩天权,费健. 胆囊黏膜ABCG5和ABCG8基因在胆固醇结石病中的作用[J].中华实验外科杂志,2007,(1):51-52.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.01.020.