大鼠肝脏低温灌注和复流模型改进及B7表达的研究

在肝脏移植手术中,移植肝冷灌注再复流损伤是一个不可避免的过程.除直接导致术后移植肝功能损害外,这种损伤还可增加供肝的免疫原性,促进急性排斥反应的发生川.研究结果显示T淋巴细胞共刺激通路参与了肾脏低温灌注复流损伤,共刺激分子在器官低温灌注复流损伤中的表达备受关注.我们在改进大鼠肝脏冷灌注复流损伤动物模型〔3〕的基础上,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测了共刺激分子B7-1和B7-2mRNA在肝组织中的表达,分析其变化规律,进一步揭示冷低温灌注复流与急性排斥反应的联系,探讨B7对移植器官损害的机制.　　材料和方法　　1.材料:Trizol试剂盒(加拿大BBI公司产品),RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司),DL2000DNAmarker(TaKaRa公司).　　2.动物分组及模型建立:雄性Wistar大鼠30只,体质量220}270g,购自山东大学动物试验中心,随机分为3组.A组(冷灌注20min再复流24h,n=10)、B组(冷灌注30min再复流24h,n-10),C组(假手术组,.-10).动物模型的建立参照胡建平等[3〕的方法加以改进:大鼠术前禁食10}12h,自由饮水,乙醚吸人麻醉,上腹直切口进腹,显露右肾上腺静脉.手术时分离出3一5mm的静脉干,用于灌注时切开作为肝灌注液流出道.游离出肝后下腔静脉,直至肝上、下下腔静脉完全游离.用5一丝线打一活结阻断肝固有动脉并以此方法阻断幽门静脉.以微血管夹分别于右肾静脉水平以上和脾静脉水平以上阻断肝下下腔静脉和门静脉.用4号半头皮针穿刺门静脉并固定,向肝脏灌注2ml含肝素常温生理盐水后夹闭肝上下腔静脉,使全肝处于无血流状态,切开右肾上腺静脉开放灌注液流出道,以20cm水柱压力经导管持续滴4℃冷灌注液,冷灌注时间为20min和30min.停止灌注后,结扎右肾上腺静脉流出道,依次开放肝上、肝下下腔静脉、肝动脉、门静脉及幽门静脉恢复肝脏血流,门静脉压迫止血约2min即可止血,关闭切口.　　3.肝脏B7-1mRNA,B7-2mRNA表达水平检测:(1)提取肝脏总RNA及cDNA合成:应用Trizol试剂盒(BBI公司,加拿大)提取组织标本总RNA,取0.5闪RNA产物,用RT-PCR试剂盒(Roche公司)将其逆转录为互补DNA(cDNA)o(2)PCR反应:选取卜actin为内参对照,B7-1,B72以及(3-actin引物参照Kojima等川的报道由山东省医学科学院合成,序列见表1,应用1%琼脂糖凝胶电泳PCR产物,EB染色,凝胶成像系统(AlphaImagerT"2200)观察电泳条带存人图像.以SPOTDENSITY软件测量内参照和B7-1,B7-2基因条带的灰度,结果用B7-1/p-actin及B7-2/(3-actinmRNA的灰度比值表示.　　4.统计学方法:数据以均数*标准差表示,应用SPSS13.0统计软件分析.多组间样本均数比较采用OneWayANOVA方差分析.　　结果　　1组织中总RNA纯度及质量鉴定:提取出的组织RNA纯度用紫外分光光度计测定,Azbo}Azs.比值为1.7一2.0,表明RNA无明显降解,说明提取的RNA均达到所需的纯度.　　2.B7-1,B7-2mRNA的表达水平:B7-1mRNA在C组几乎不表达,而在A组和B组则明显表达(P<0.O1);B7-2mRNA在C组几乎不表达,而在A组和B组则明显表达(P<0.O1)o87-1,B7-2mRNA的表达水平在A组和B组之间差异有统计学意义(P<0.01,图1,表2).　　讨论　　目前研究肝脏冷灌注复流损伤通常采用两种方-法,一是对离体肝脏行人工或机械灌注法;二是原位肝脏移植法.前者虽然模仿低温灌注过程,但不能产生血液再复流过程.原位肝移植虽能模拟肝低温灌注再复流全过程,但由于手术操作复杂,动物创伤大,死亡率高.本实验采用肝脏冷灌注复流模型‘3并加以改进.本模型包含灌注、再复流过程,既能模拟离体、半离体肝切除手术过程,也能模拟活体供肝肝移植的供肝灌注、再植过程.本模型保留了原模型的特点,应用门静脉及腔静脉的固有属支作为灌注液流人和流出道,保持了门静脉和腔静脉主干的完整性,易于操作.　　并避免了原模型利用脾静脉作为灌流流入道,灌流结束切除脾脏缺点.与原模型比较,改变了冷灌注的流入道,保留了脾脏,最大限度地保证了门脉系统血流动力学的稳定和脾脏的免疫功能.　　肝脏冷灌注复流损伤为肝脏移植的重要病理生理过程,它存在于肝脏的切取、保存以及移植手术的各个环节.灌注复流损伤影响移植后肝脏的功能,与更为严重的原发性无功能有密切关系,并且增加了发生急性排斥反应的概率,细胞介导的免疫反应在同种异体急性排斥反应中起主要作用.T细胞活化与增殖依赖于双信号,一是抗原呈递细胞呈递的抗原肤一人类主要组织相容性复合体(MHC)复合体信号,此信号对T细胞活化是必需的;二是共刺激信号,共刺激信号为T细胞抗原特异性激活所必需,其中主要的共刺激因子是B7家族成员B7-1和B7-2,与T细胞上其的受体起着信号传递、增强或放大免疫反应的作用.　　Singh等[7〕在肾脏缺血再灌注损伤时发现B7分子表达的增加.在大鼠肝脏冷缺血再灌注模型中,模型组共刺激分子B7-1,B7-2mRNA表达较假手术组有明显上调,并且随着缺血时间延长,B7-1,B7-2水平进一步增高,说明确实发生了冷缺血再灌注损伤,与采用肾脏模型观察到一致的结果.Lu.等「A)观察到缺血灌注损伤时MHC抗原表达增高,进而增加了供肝的免疫原性.本研究结果表明,供肝的免疫原性在经过冷缺血再灌注打击后还可通过B7-1和B7-2mRNA的表达上调而增高.因此,供肝的免疫原性增高将预示受体更易发生急性排斥反应.　　本实验结果证实,肝脏冷缺血再灌注损伤可以引起B7-1,B7-2表达增高,并且随着缺而_再灌注时间延长,B7-1,B7-2水平进一步增高;组织的缺血再灌注损伤越重.检测B7-1,B7-2表达从而预测缺血再灌注损伤的程度,对排斥反应的监测有一定帮助,B7-1和B7-2将成为抑制与肝移植相关的肝脏缺血再灌注损伤后早期排斥反应的新靶点.　　参考文献　　赵继学,张海玉,杨志明. 丙氨酰-谷氨酰胺二肽预处理对大鼠心脏停搏供体肝移植缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华实验外科杂志,2006,(12):1473-1475.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.12.016.　　Bestard O,Campistol JM,Morales JM. Advances in immunosuppression for kidney transplantation:new strategies for preserving kidney function and reducing cardiovascular risk[J].Nefrologia,2012.374-384.　　胡建平,钱建民,王学浩. 大鼠原位肝脏低温灌注和复流模型的建立及意义[J].中华实验外科杂志,2001,(4):366-367.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2001.04.034.　　Kojima N,Sato M,Suzuki A. Enhanced expression of B7-1,B7-2,and intercellular adhesion molecule 1 in siuusoidal endothelial cells by warm ischemia/reperfusion injury in rat fiver[J].Hepatology,2001.751-757.　　宋茂力,邹小明,李刚. 羟乙基淀粉溶液对猪小肠移植缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华实验外科杂志,2007,(12):1543-1544.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2007.12.033.　　秦涛,申明媚,毕德琼. 人IκBα突变体在大鼠肝移植急性排斥反应中的作用[J].中华实验外科杂志,2006,(12):1486-1487.doi:10.3760/j.issn:1001-9030.2006.12.021.　　Singh KA,Kampen RL,Hoffmann SC. Renal epithelial cell-derived monocyte colony stimulating factor as a local informant of renal injury and means of monocyte activation[J].Transplant International,2009.730-737.　　Luo L,Lu J,Wei L. The role of HIF-I in up-regulating MICA expression on human renal proximal tubular epithelial cells during hypoxia/reoxygenation[J].Bmc Cell Biology,2010.91-103.