高渗应激对肝细胞癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响

高渗应激在炎症、肿瘤发生发展过程中发挥重要作用.活化T细胞核因子5(NFATS)是已知的唯一的哺乳动物细胞渗透压敏感转录因子,在免疫、感染、癌症、发育和细胞迁移等方面起重要作用.本研究旨在利用肝细胞肝癌组织标本和体外培养的肝癌细胞株,观察转录因子NFATS的表达及模拟高渗应激对肿瘤细胞凋亡和增殖的影响.　　材料与方法　　1,一般资料:选取2009年1月至2011年12月武汉大学中南医院普外科手术切除的肝细胞肝癌癌组织,相应癌旁组织64例,年龄(54.6士9.6)岁;其中50例为男性(78.13%),14例为女性(21.87%).所有标本取材后立即用多聚甲醛固定、石蜡包埋备用,各例标本均在病理学」_得到武汉大学中南医院病理科证实,所有患者在术前均未接受过针一对肝脏肿瘤的放化疗、肝动脉化疗栓塞(TALE)、经皮无水乙醇注射(PEI),射频消融(RFA)等特殊治疗.兔抗人NFATS抗体(ChIP级)购自英国Abcam生物技术公司,多聚甲醛液、磷酸盐缓冲液(PBS)、柠檬酸抗原修复缓冲液、二氨基联苯胺(DAB)酶底物显色剂、链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(SP)试剂盒等均购自福建迈新生物技术公司.　　2.免疫组织化学及结果判定:采用免疫组织化学SP法,石蜡包埋切片70℃烘箱30min,梯度乙醇脱蜡,无菌PBS冲洗3min重复3次;柠檬酸抗原修复缓冲液(pH二6.0)中750W微波炉约950C加热10min后,室温冷却,PBS冲洗3min重复3次;5%过氧化氢0.2m1,370C温箱10min,PBS冲洗3min重复3次;二抗来源动物血清37℃15min封闭,弃去封闭血清(不洗),滴加一抗NFATS抗体(1:200),4℃过夜)PBS冲洗3min重复3次,加生物素化二抗37℃20minPBS冲洗后DAB显色;常规复染,脱水,透明,树胶封片后观察.无菌PBS液代替一抗作为阴性对照.由2名研究者以双盲原则评定.以淡黄色至黄褐色着色为阳性表达,综合表达强度和阳性细胞百分比进行评价:(1)表达强度:不着色0分,淡黄色I分,棕黄色2分,黄褐色3分;(2)阳性细胞百分比:0%0分,1%-10%1分,11%一500702分,>50%3分.最终得分为两者乘积,达到4分为阳性,其余为阴性.　　3.细胞培养及渗透压微环境的建立:肝癌细胞株Huh?细胞培养于含10%胎牛血清(FBS,四季青公司)、含双抗(100U/ml青霉素和100mg/L链霉素)的DMEM(Gibco公司)培养基中(370C,5%CO).用于实验时为700}0融合细胞并加入分析纯NaCI,使各组培养基中NaCl相应终质量浓度分别为0,50,100mmol/L,并继续培养24h.　　4.Westernblot检测NFATS蛋自表达:收集不同渗透压处理的各组细胞,蛋白提取液提取蛋白,Bradford法定量蛋白,8%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(目的蛋白NFATS为160xlO6),转正电荷尼龙膜(PVDF膜),5%牛血清白蛋白(BSA)室温、摇床约封闭1h,兔抗人NFATS(1:2000)室温孵育1h,羊抗兔二抗(1:5000)室温孵育Ih,化学发光法检测(ECL),以a一肌动蛋白((3-actin)作为内参照.　　5.流式膜联蛋白V-藻红蛋白(AnnexinV-PE)检测细胞凋亡:收集各组细胞,加人预冷的PBS洗涤细胞2次,收集5x105个细胞,加人500N,lBanding缓冲液重悬细胞,加人5}1AnnexinV-PE和5},l4’,6一二眯基一2-苯基叫喋(DAPI),轻柔混匀,室温下避光孵育10min,1h内进行流式细胞仪分析,检测各组细胞凋一亡,重复实验3次取均数.　　6.嚎哩蓝(MTT)比色法检测Huh?细胞株增殖活力:取对数生长期的Huh?细胞,按2x1了个/孔接种于%孔板中,加细胞悬液100闪/孔,每组设3个复孔,置370C,5%aCOz培养箱培养24h后,各组同步更换2%胎牛血清培养基,实验组加人NaCI;(终质量浓度100mmol/L),空自对照组加人等体积培养基,使各孔体积均达到200},l.培养8,16,24,32,48h后,每孔加人5g/I.MTT20闪,37℃下作用4h后,去除每孔中的液体,每孔加人DMSO200闪,在自动酶标仪490nm处测量各孔的吸光度(A)值.以A值为纵坐标,培养时间为横坐标绘制细胞生长曲线.计算细胞增殖抑制率,抑制率(%)-(A二加.组一A实验组)/A空白哪组x1007.统计学方法:应用SPSS18.0统计软件分析,数据以均数士标准差表示,配对组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析〕.　　结果　　1.转录因子NFATS在HCC患者癌组织与癌旁组织中的表达:在HCC中癌组织NFATS的表达明显低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05,表1).在癌组织和癌旁组织中,NFATS阳性表达分别为6例(9.38%)和44例(68.75%)癌与癌旁共同阳性表达的占9.38%(6/64),共同阴性表达的占31.25%(20/64).未见在癌组织阳性表达而在癌旁组织中阴性表达.NFATS阳性表达主要集中于细胞质.　　2.渗透压应激对Huh?肝癌细胞株NFATS蛋白表达的影响:Westernblot检测结果显示,与空白对照组(A组)比较,实验组(B,C组)在高渗诱导下NFATS蛋白表达量显著增强(P<0.01),而B组(50mmol/L氯化钠)与C组(100mmol/L氯化钠)之间差异无统计一学意义(P>0.OS,图1).　　3.渗透压应激对肝癌细胞Huh?细胞凋亡的影响:流式细胞仪检测结果显示,空自对照组、50mmol/L氯化钠组、100mmol/L氯化钠组的细胞凋亡率分别为(0.8士0.2)%、(13.2士1.2)%和(26.0士3.2)0l0.与空白对照组比较,实验组的细胞凋亡率均显著增加(P<0.O1).　　4.渗透压应激对肝癌细胞Huh?细胞增殖的影响:MTT比色法检测结果显示,实验组(100mmol/LNaCl)的细胞生长速度较空白对照组明显减慢,差异有统计学意义(P<0.01).在8,16,24,32,48h检测细胞增殖抑制率(%)分别为8.34士0.17,19.26士1.04,31.35士2.09,35.41注2.38,36.54士2.40,说明高渗应激能明显抑制肝癌细胞生长.且在24一48h,高渗环境对肝癌细胞增殖的抑制作用较前24h变缓.　　讨论　　转录因子NFAT家族在癌症进展中的作用已经得到足够的重视〔3'凋亡相关基因亦是肝癌研究的热点4}oNFAT、中NFATI一4对钙调磷酸酶敏感,有钙连接位点,而NFATS却没有,是家族中唯一非钙调控亚型,显得极为独特.NFATs在肝脏肿瘤的认识非常有限,我们团队也做了初步探索[si.目前认为,高渗压力下,NFATS能促进渗透压保护基因的转录,例如醛糖还原酶(AR)、牛磺酸转运蛋白(TauT)等,但高渗并不一定会上调NFATS的表达二本研究旨在探讨肝细胞癌组织中NFATS的表达及高渗应激对肝细胞癌Huh?细胞增殖和凋亡的影响.　　既往在体外培养的结肠癌细胞实验中,高渗诱导下,NFATS介导的Src激酶通路被激活并增强了结肠癌细胞的肿瘤学特性.假说认为在结肠癌餐后渗透压增高,NFATS被高渗压力激活(大约430mosM/kg).但是,肝脏与肾脏及胃肠道器官明显不同,暴露于渗透压温和改变的环境中,在这个狭窄的生理范围内,激素、氧化应激等都能诱导肝细胞膨胀或收缩.正常肝细胞体积变化触发代谢、运输、基因表达等的信号转导.在低渗灌注大鼠肝脏时,肝细胞在低渗状态下发生肿胀,激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),蛋白水解抑制[s-9}.另一方面,高渗状态下,肝细胞皱缩脱水,激活CD95并最终诱导凋亡yob.进一步对渗透压与肝细胞凋亡关系的研究结果显示,低渗状态下通过激活整合素(Integrins)/Src/p38MAPK信号通路诱发肝细胞凋亡抑制;而高渗状态通过激活还原型烟酞胺腺嘿吟二核昔酸磷酸(NOX)/活性氧(ROS)/CD95促进肝细胞凋亡〔川.由于没有癌组织渗透压的相关资料,是否癌性肿瘤与周围组织或血液在渗透压上有巨大不同,从而影响了NFATS的活性以及渗透压对肝癌细胞的影响报道目前尚少.　　我们通过免疫组织化学方法检测64例肝细胞肝癌组织NFATS的表达,结果显示在HCC中癌组织NFATS的表达明显低于癌旁组织,阳性表达细胞定位主要集中于细胞质.我们用普通培养基加人NaCl模拟高渗应激环境培养细胞.事实上,DMEM培养基本身渗透压约为309mosM,与正常生理状态及生理盐水相当而0.9%生理盐水所含NaCl浓度都远大于100mmol/L,这种高渗刺激是相当温和的.结果显示,高渗应激明显上调了肝癌细胞株Huh?NFATS蛋白的表达,并且能明显促进肝癌细胞凋亡和抑制肝癌细胞增殖它提示在肝细胞肝癌的形成过程中,可能肿瘤微环境的渗透压会降低,从而下调了重要的渗透压相关转录因子NFATS,进一步抑制了肝癌细胞凋亡和促进肝癌细胞增殖,并最终促进了肝细胞肝癌的发生和发展同时,是否能以高渗盐水或其他仅仅改变局部渗透压的方法代替无水乙醇来进行肝脏肿瘤的穿刺微创治疗,以减小不良反应和NFATS信号通路具体分子机制等,尚有待进一步研究.　　参考文献　　Burg MB,Ferraris JD,Dmitrieva NI. Cellular response to hyperosmotic stresses[J].Physiological Reviews,2007.1441-1474.　　Halterman JA,Kwon HM,Wamhoff BR. Tonicity-independent regulation of the osmosensitive transcription factor TonEBP(NFAT5)[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology,2012.C1-C8.　　Mancini M,Toker A. NFAT proteins:emerging roles in cancer progression[J].Nature Reviews Cancer,2009.810-820.　　王亚进,余耀,周俭. bcl-2基因在肝癌中的研究进展[J].中华实验外科杂志,2012,(1):154-155.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.01.064.　　张进,刘志苏,刘权焰. 激活的T细胞核因子家族在肝癌与癌旁组织中的差异表达[J].中华实验外科杂志,2012,(2):237-239.doi:10.3760/cma.j.issn.1001-9030.2012.02.024.　　Tong EH,Guo J J,Huang AL. Regulation of nucleocytoplasmic trafficking of transcription factor OREBP/TonEBP/NFAT5[J].Journal of Biological Chemistry,2006.23870-23879.　　Chen M,Sastry SK,O' Connor KL. Src kinase pathway is involved in NFATS-mediated S100A4 induction by hyperosmotic stress in colon cancer cells[J].American Journal of Physiology-Cell Physiology,2011.Cl155-C1163.　　Haussinger D,Schliess F,Dombrowski F. Involvement of p38MAPK in the regulation of proteolysis by liver cell hydration[J].Gastroenterology,1999.921-935.　　Kurz AK,Graf D,Schmitt M. Tauroursodesoxycholate-induced choleresis involves p38(MAPK)activation and translocation of the bile salt export pump in rats[J].Gastroenterology,2001.407-419.　　Reinehr R,Graf D,Fischer R. Hyperosmolarity triggers CD95 membrane trafficking and sensitizes rat hepatocytes toward CD95L-induced apoptosis[J].Hepatology,2002.602-614.