增殖1阻断基因在肝癌组织中上调并促进癌细胞的迁移

肝细胞肝癌是恶性程度最高的肿瘤之一,目前肝癌形成和发展的分子机制仍不甚明了,研究结果显示其与众多基因的异常表达有关.一些基因在组织的恶性转变、肿瘤的发生发展中起了重要作用,增殖1阻断(BOP1)基因是新近发现的定位于染色体8q24上的肿瘤相关基因,研究结果显示此段的区域染色体扩增在人类多种肿瘤发生中很常见乞2l.有报道称BOPl参与结直肠癌的发生,其表达水平与结直肠癌的临床病理特征有密切关系.目前BOP1基因在不同肿瘤中的研究较少,在多种肿瘤中的表达报道目前尚少.　　有关文献称BOP1基因可促进上皮向间质的转变(EMT),进而促进肿瘤的发生、推测BOPl的表达可能会与肝癌的发生有关.本研究旨在观察BOPl基因在肝癌组织中的表达及对肝癌细胞功能的影响.　　材料和方法　　1一般资料:实验标本取自上海市第一人民医院诊治的45例男性肝癌患者,并取相应的距离肿瘤组织>5cm的正常肝脏组织做为对照.样本组织全部获得病理学诊断:肝细胞肝癌.mRNA提取试剂盒(Qiagen公司),逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)试剂盒(Fermentas公司),肝癌HepG2细胞株购自中国科学院土二海生命科学研究院细胞资源中心.PEGFP-N1-BOP1重组载体由上海锐赛生物技术有限公司构建Lipofectamine2000,Trizol试剂(美国Invitrogen公司),胎牛血清、RPMI1640培养基(美国Gibc.公司),蛋白提取浓度测定试剂盒(碧云天公司),鼠抗人绿色荧光蛋白(GFP)单抗、鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单抗(美国SantaCruz公司),细胞计数试剂盒(CCK-8)试剂盒(日本同仁公司),FQ-PCR仪器购自德国Eppendorf公司.　　2.mRNA的提取和cDNA合成:mRNA的提取按照AllprepDNA/RNAMiniHandbook进行操作,用ThermoScientificNanoDrop2000/20000分光光度计检测提取的mRNA浓度,并经琼脂糖凝胶电泳检测mRNA质量.逆转录采用Fermentas逆转录试剂盒,反应体系为20闪:mRNA3Ng(根据mRNA浓度取相应体积),随机引物1闪,缓冲液4闪,Rnase抑制剂1闪,10mmol/LdNTPMix2闪,逆转录酶1闪,无核酸酶水补足20p,1.反应条件为:250C5min,420C60min,70℃5min.　　3.FQ-PCR过程:依据SYBRGreenqPCRMasterMix进行.为校准每微升体积cDNA含量的不同,选用18S作为内参,引物见表1,反应条件:95℃预变性10min,然后95℃变性10s,60℃退火20s,720C延伸1min,共42个循环,再进人融解程序:95℃5s,55℃5s,95℃5、.用2一,计算结果.　　4.BOPl基因pEGFP-NI表达载体的构建:针对BOPl基因CDS区设计并合成PCR引物(表1),在目的基因的5’端添加XhoI酶切位点,3’端添加EcoRI酶切位点.以购买的基因为模板,PCR扩增BOPl基因序列,PCR体系50闪,反应程序:94℃预变性3min,然后940C变性30s,56℃退火30s,68℃延伸140s,共35个循环,再68℃充分延伸10min.分离回收目的片段,将目的基因片段与pEGFP-N1连接,转化感受态细胞DHS.筛选PCR和酶切鉴定均呈阳性的克隆测序验证.PFGFP-N1-BOPI质粒结构图见图1.　　5.细胞培养及转染:HepG2置于含10%胎牛血清的1640培养基中,在37℃,5%COz、饱和湿度条件下进行常规培养,细胞生长至90%融合时消化传代.转染时取对数生长期的细胞约1x105个孔接种于12孔板,加人适量RP'VTI1640培养基培养24h,使细胞生长稳定并达到50%一60%的贴壁融合)按Lipofectarmine2000说明书进行转染,转染分实验组(转染目的基因BOPl的质粒pEGFP-Nl-BOPl)、对照组(转染空白质粒,pEG-FP-NC)、亲本细胞组(未进行转染的HepG2细胞),于转染6h后更换培养基,培养箱中孵育48,72h后收集细胞二倒置荧光显微镜下观察转染效率.　　6.BOP1基因在HepG2细胞中的表达:收集各组HepG2细胞,按Trizol和逆转录试剂盒说明书分别提取细胞总RNA和逆转录为cDNA.采用SybrGreenFQ-PCR检测细胞中BOPlmRNA的表达,选用18S作为内参,引物见表1,用公式2-o}}}计算表达差异.采用Westernblot检测各组细胞中BOP1蛋自的表达.　　按照说明书提取细胞总蛋白并测定浓度,聚丙烯凝胶分离,转膜,5%脱脂奶粉封闭,依次用鼠抗人GFP单克隆抗体(1:1000稀释)、鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1:5000稀释)的一抗孵育和羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1:5000稀释)孵育,化学发光法显影检测.　　7.细胞增殖实验:将处于对数生长期的HepG2细胞约3x103个/孔接种于无菌96孔板(100p,1/孔),24h后进行转染,同样分为实验组、对照组、亲本细胞组,每组设3个平行孔.在转染后的1一5d,每孔加人10浏的CCK-8液,37℃5%C0,培养箱培养1h,用酶标仪测定450nm的吸光度(A)值.　　8.细胞迁移实验:将HepG2细胞按6/10a个细胞/孔密度接种于6孔板,培养24h至细胞融合达50%左右,转染及分组同细胞增殖实验.待细胞长至70%一80%融合时,用1000闪无菌移液器枪头沿培养板底部划1条直线,宽约8mm,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,洗去被划下的细胞.在倒置显微镜下观察划痕后12,24,36,48,60,72h细胞的迁移,并测量细胞向中线移动的距离.　　9.统计学方法:应用S1'SS16.0统计软件分析,计量资料以均数士标准差表示,组间差异比较采用配对t检验和方差分析.　　结果　　1.FQ-PCR结果:BOP1mR1VA在45例肝癌及其相应正常组织中,有39例在肿瘤组织中(86.7%o)表达上调,而仅有2例(4.4%)表达降低,4例(8.9%)在正常组织和肿瘤组织中表达差异无统计学意义(p>0.O5).BOPlmRNA在肿瘤组织表达水平为巧.16士1.86,正常组织为17.48士2.68,肝癌组织表达量明显高于正常组织(P<0.01,图2).　　2.转染效率的倒置荧光显微镜下观察:pFGFP-NC,pEGFP-1V1-BOPl分别转染HepG2细胞48h,72h后,倒置荧光显微镜下可见各转染组细胞中呈现绿色荧光,72h荧光最强,转染效率约为50%,亲本细胞组未见绿色荧光.　　3.BOPl在HepG2细胞中的过表达:转染72h后,FQ-PCR结果显示,亲本细胞组和对照组BOP1mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),而实验组表达量显著上调(>80倍).Westernblot法结果显示,亲本细胞组未出现目的蛋白条带,转染空白质粒的对照组仅出现GFP蛋白条带(相对分子质量为26x103),而实验组出现GFP和BOP1的融合条带(相对分子质量为犯x103).以上结果表明基因转染成功,见图3.　　4.细胞增殖实验结果:亲本细胞组(HepG2)、对照组(HepG2-N};)和实验组(HepG2-BOP1)在转染后的1一Sd经CCK-8检测结果显示亲本细胞组和对照组细胞的A值差异无统计学意义(P>0.05),而实验组细胞的A值显著升高,过表达BOPl能明显促进HepG2细胞的增殖(P<0.05,图4).　　5.细胞迁移实验结果:转染后每12h连续观察测量,结果显示实验组向划痕部位迁移的速度明显加快,72h时亲本细胞组和对照组划痕仍有缝隙,而实验组完全愈合,差异有统计学意义(P<0.01,图5).　　讨论　　BoPi基因是一个}VD40蛋自,首次发现是与小鼠胚胎成纤维细胞的成长有关一s}.早期在小鼠成纤维细胞的研究结果显示BOPl参与核糖体RNA的生成,与其完整性有关然而,近来的研究着重于BOP1在核糖体外的功能.研究结果显示,在酵母中BOPl通过在有丝分裂中期向后期的过渡中精确染色体的分离,在维持基因组的完整性中发挥重要作用〔}J.在染色体中,BOPI和Peseadillo(Pesl)形成一种稳定的复合体,据相关文献称,失去Pesl-BOPl复合体的完整性可以导致前rRNA的成熟缺陷和TP53依赖的细胞周期停滞〔7〕,这和肿瘤的发生有密切关系.在结直肠癌,BOP1的过表达促进肿瘤的发生,在染色体的不稳定和组织的恶性转变中起重要作用s}　　目前研究BOPl与肝癌发生发展的关系国内尚无报道.在前期实验中,我们选取45例肝癌患者的肿瘤组织和相应正常组织,通过FQ-PCR检测BOPlmRNA的表达,发现BOPl基因在肿瘤组织的表达显著高于相应正常组织,这种差异表达促使我们思考BOPl的高表达在肝癌发生、发展中可能的作用.目前,基因克隆、基因转染已成为明确基因功能的主要手段{yJ,为进一步深人研究,我们采取克隆构建BOP1真核过表达载体转染肝癌细胞株的方法观察BOP1基因过表达对细胞功能的影响.　　增殖和运动特性的差异是肿瘤细胞区别于正常细胞显著的一面,因此本实验中我们主要检测BOP1过表达在这两方面的作用.考虑到肝癌HepG2细胞转染效率比较高,属于低侵袭性低转移潜能的细胞株,这样有利于运动迁移实验的结果较为明显一些,故选择肝癌HepG2细胞进行实验通过FQ-PCR,Westernblot方法验证转染成功,可见过表达BOP1基因可以促进HepG2细胞的增殖,实验组细胞的A值显著高于对照组,说明实验组细胞的增殖速度要明显快于对照组.在划痕迁移实验中,通过转染后每隔12h连续3d观察细胞向中线的迁移,我们观察到实验组划痕的愈合速度明显快于对照组,说明过表达BOPl可以明显提高HepG2细胞的运动能力.　　本研究结果表明,BOPl基因在肝癌组织中表达上调,并且可以促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,因此BOPl基因促进肝癌的发生发展,但其作用机制有待进一步研究.　　参考文献　　Chen XP,Qiu FZ,Wu ZD. 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