阻断Hedgehog信号通路可抑制胆管癌细胞QBC939的生长

胆管癌占消化道肿瘤的30a，其年发病率为2}-4/100 000，并且近年来发病率逐渐上升，是恶性程度最高的致死性肿瘤之一。由于侵袭性强，缺乏有效的早期诊断方法，确诊时往往已经发生转移，诊断后中位生存期不到6个月，预后很差。因此，加强胆管癌基础研究，提高临床诊疗水平，改善患者预后，仍是迫切需要解决的问题。Hedgehog(HH)信号通路是在动物胚胎发育过程中调节细胞间相互作用的重要信号分子之一。特异性阻断剂可以抑制由HH信号引起的细胞反应。它主要通过对抗HH下游分子SMO而抑制hedgehog信号通路的活性，但并不是一种全身性的化疗药物，对机体的其他部位不会产生副作用。这一发现使肿瘤治疗成为一种真正意义上的靶向性治疗u-}}。目前对HH信号传导通路在胆管癌中的表达及致病机制研究甚少。本研究通过环靶明在体外特异性阻断人胆管癌细胞系QBC939中的HH信号传递，观察其对胆管癌细胞增殖和凋亡的影响，旨在为胆管癌的临床诊断、治疗及预后提供依据。

材料与方法

1.材料、试剂和仪器:人胆管癌细胞系QI3C939由中国湘雅医学院细胞中心馈赠。4-6周龄BAI_B/C裸鼠由四川大学华西医学院实验动物中心提供，体重16-}-2 0 g。环靶明购自美国LC Laboratories公司番茄碱(环靶明类似药物)购自美国Sigma公司。RPMI1640细胞培养基、胎牛血清购自Gibe。公司。四甲基偶氮哇蓝(MTT)购白美国Sigma公司。Annexin U-FITC/PI试剂盒购自凯基生物技术公司。俘-actin抗体、兔抗人Gli-1抗体、羊抗人ptchl抗体购自美国Santa Cruz公司。鼠抗人EGFR抗体购自北京博奥森生物公司。RT-PCR试剂盒和Western blot试剂盒购自美国Sigma公司。免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司俘-actin及ptchl}Gli-1}EGFR基因引物由上海生物工程有限公司合成。Trizol RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen。流式细胞仪为美国BD公司F ACS Calibur型。

2.细胞培养及处理:人胆管癌细胞系QBC939根据ATCC C AmericanType Culture Collection)提供的培养条件置于37 0C,}0oC0培养箱培养。细胞均贴壁生长，每2-}-3 d传代1次传代时移去旧培养液，PBS洗涤2次.然后加人。2;p胰酶消化，离心(1000 r/min,7 min)·培养液重悬，接种于培养瓶。复苏后，加人含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置于37 0C,50o CO饱和湿度的(')培养箱中培养。

3.不同浓度环靶明在体外处理人胆管癌细胞系QBC939:将QBC939细胞以1X10个/瓶浓度接种于25 ml培养瓶中，用含100oFBS的MEM培养液培养细胞24 h后分组处理。空白组(含QBC9 3 9细胞、100oFBS的MEM培养液)、对照组(含QBC939细胞、100oFBS的MEM培养液，番茄碱5}mol/L)}5}mol/L环靶明组(含QBC9 3 9细胞、100oFBS的MEM培养液、环靶明5}cmol/L),10 umol/L环靶明组(含QBC939细胞、100oFBS的MEM培养液、环靶明10}cmol/I.)继续置于37℃、5 0 o CO2培养箱培养48 h后实验检测。

4.处理后QBC939细胞RNA的提取与荧光实时定量PCR检测:在环靶明处理QBC939细胞48 h后分别收集各组细胞，用Trizol RNA抽提试剂提取细胞中的总RNA。具体操作按试剂盒操作说明书进行。提取细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo<dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。引物序列为:PTCH1上游引物序列5'-A丁TCAACCAAACCTCTTGAT-3',PTCH1下游引物序列，5'-GAGTCATTAACTGGAACA-TA-3';GLIl上游引物序列，5'-CTGGTGCACCA-CATCAACAG-3',GLIl下游引物序列，5'-CCT-TCAAACGTGCACTTGTGT-3';EGFR上游引物序列，5'-CTCACTCTCCATAAATGCTAC-3',EGFR-卜游引物序列，5'-AGAAAACTGACCAT-GTTGCTT-3';GAPDII上游引物序列，5'-TGA-CATCAAGAAGGTGGTGA=3',GAPDH下游引物序列，5'-TCATACCAGGAAATGAGCTT-3'o由熔解曲线和琼脂糖凝胶电泳判断PCR反应的特异性。用基于2-}}Ct方法进行相对定量分析。

5.处理后QBC939细胞的W estern blot检测:W estern blot从液氮冻存组织或对数生长细胞提取总蛋白.按照本实验室的操作步骤进行实验，使用的一抗分别为兔抗人Gli-1抗体((1:200)、羊抗人ptchl抗体(1，200),鼠抗人EGFR抗体(1，200)份actor抗体(1，200)。结果经成像系统及分析软件进行图像扫描。

6.MTT法检测环靶明抑制QBC9 3 9细胞的增殖:QBC939细胞用含100oBCS的RPMI 1640培养基常规消化传代培养。待培养瓶中传代细胞融合生长至80%左右，以2.0 X 10'i个/孔的密度接种96孔板培养24 h，用无血清培养液同步化24 h。实验组分别加人2.5,5.0,10.0,20.0 umol/L浓度的环靶明(用无水乙醇稀释)，阴性对照组加人相应浓度番茄碱，每种浓度均设5个复孔;空白对照组仅加人等体积培养液。作用48 h后，每孔加人MTT C5 mg/mD 20日继续培养4h。吸弃孔内液体，每孔加人150尸的DMSO，室温振荡10 mina酶标仪490 nor波长处测定各孔吸光度(A)值，实验结果重复3次。方法同上，接种6张96孔板，再选取10.0}mo1/L环靶明作QBC93，细胞，分别培养0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 d后进行MTT法检测。方法同上，期间隔日更换相同浓度药物的新鲜培养液，实验结果均重复3次。

7.Annexin-V-FITC/PI双染法检测环靶明促进QBC939细胞凋亡:将QBC939细胞以1.0 X 100个/孔的密度接种至6孔板培养过夜，无血清培养液同步化24 h(同步化方法同上)，吸弃培养液。实验组分别加人5.0,10.0,20.0 umol/L的环靶明(用无水乙醇稀释)，阴性对照组加人番茄碱，每浓度均设3个复孔;空白对照组不加药物。作用48 h后，用。.2500胰酶将细胞消化为单细胞悬液，分别取100川(每管约含1X105个细胞)，按试剂盒操作说明书(凯基生物公司)进行Annexin-V-FITC(膜联蛋白V)和PI(碘化毗陡，50}g/ml)双重染色，流式细胞仪检测凋亡。实验结果均重复3次。

8.统计学处理:应用SPSS 11.0软件统计软件处理数据。采用X检验，单因素和多因素方差分析，PLO.05为差异有统计学意义。

结果

1.细胞形态学改变情况:QBC939细胞经浓度为10}mol/I.环靶明作用后，倒置显微镜下观察发现，其生长减慢，细胞形态受损，细胞间连接减少或消失，部分细胞皱缩，核固缩现象明显，出现较多悬浮的单个细胞。随着时间的增加，上述特征更加明显。番茄碱组和空白对照组的细胞分布均匀，大小基本一致，核固缩现象及悬浮的单个细胞偶见(图1)。

2.环靶明体外处理QBC9 3 9后PTCH1,GLI1,EGFR的mRNA表达下调:荧光实时定量PLR检测结果显示各组QBC939细胞中均存在PTCH1,GLI1,EGFR的mRNA表达，并且5}mo1/L和10}cmol/I_环靶明组PTCH 1,GI_Il,EGFR的mRNA表达较对照组表达下调。PTCH1,GLI1,EGFR和GAPDH基因PCR产物的熔解曲线均仅有1个峰，说明为单一片段扩增，熔解温度分别为PTCH 186.5 0C,GLI 189.0 0C,EGFR 85.6 0C,GAPDH 89.1℃。分别PCR扩增产物的琼脂糖凝胶水平电泳检测PTCHl,GLI1及EGFR及GAPDH RT-PC;R扩增产物凝胶电泳检测，发现有特异的目的条带长度分别约为170,166,271,177 by，与PTCH1、GLIl、EGFR,GAPDH基因大小的理论值相符(图2)。扩增GAPGH和PTCHI,GLI1,EGFR每样本作2复孔，得到两组Ct平均值5}mol/I和10}Cmol/L环靶明组与番茄碱对照组比较，环靶明组P'I'CHl,GLIl,EGFR的2-ppCt显著减少(PC0.01)，表明PTCHl,GLII,EGFR的mRNA表达下调，EGFR mRNA下调则明显(图3) 

3.环靶明体外处理QBC:939细胞后PTCHl,GLIl,EGFR的蛋白表达下调:Western-blot检测结果显示，胆管癌细胞系QPC939存在PTCH1,GLI1,EGFR的蛋白高表达。环靶明处理后，PTCH 1,GLI1,EGFR的蛋白表达有下调的趋势CP>0.0l)。但5 umo灯L和10 umol/L的环靶明处理组之间PTCHl,GLIl蛋白表达变化不大，而EGFR蛋白表达下调则明显(P>0.01)。结果如图4所示。

4.MT"I'法检测环靶明对QBC939细胞生长的抑制作用:MTT比色法检测不同浓度的环靶明调控HII信号转导通路对QBC939细胞的影响(图5)，可见环靶明对QBC939细胞生长抑制的影响，有一定的剂量依赖性，统计学分析与对照组相比差异有统计学意义(P>0.O1)，在5}-20}}mo1/L有明显的抑制作用。选取10}mol/I.浓度环靶明作用于培养的细胞，以药物作用天数为横轴.分别以实验组、对照组与空白组的吸光度比值为纵轴绘制细胞生长曲线(图6)，可以发现随着环靶明作用于QBC939细胞时间的延长，细胞的生长能力有明显下降，与对照组和空白对照组相比差异有统计学意义(P>0.0l)。不同作用时间的吸光度值差异亦有统计学意义(尸>0.05)。而mat idine对照组和空白组对QBC939细胞作用则不明显，统计学分析差异无统计学意义(P>0.05)o 5.环靶明促进QhC939细胞的凋亡:随着环靶明作用浓度的增加，QBC939细胞凋亡率也逐渐增加。5,10,20}mo1/L环靶明分别作用于QBC939细胞48 h后的细胞凋亡率依次为(6.67士0.84)0 o,(13.64士1.2)0o,C24.59士2.1)00，而对照组的凋亡率为((1.21士1.3)00，各组间差异有统计学意义(图7，P>0.0l)。

讨论

HH信号转导通路是一个经典的胚胎发育信号系统，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要作用z-"}o hedgehog信号通路过度激活可引起多种肿瘤细胞的异常增殖.并且在肿瘤细胞增殖与凋亡的调控中起着重要作用二〕。在对消化道肿瘤的研究中，发现绝大部分肿瘤(包括起源于食管、胃、肝脏、胆管以及胰腺的肿瘤)中，IIH通路的活性是增加的，其活性可受到通路拮抗剂环靶明的抑制。目前，关于I-Iedgehog信号通路在胆管癌中的表达状态以及环靶明刘一胆管癌细胞增殖、凋亡影响作用的文献报道甚少。本实验以胆管癌细胞系QBC939为研究对象，通过对胆管癌细胞QBC939的研究，拟证实环靶明对胆管癌细胞生长、增殖以及凋一亡的影响，为胆管癌的临床诊断、治疗及预后提供依据。

本实验发现，HH信号通路在QBC939细胞中呈高激活状态。既往研究证实.PTC'Hl不仅是HH信号的受体.同时一也是HH信号通路的目的基因，是该信号通路重要的负反馈调节因子;而GI_Il是HH信号通路下游的一个重要因子，起着承上启下的关键性调控作用PTCH1和G I_工1的高表达是Hh信号通路的过度激活的重要特征’61吕si。通过Western blot及RT-PCR结果显示，PTCI i1,GLIl蛋白及mR}A呈高表达状态(图4>;这与该通路在其他上述其他恶性肿瘤中的表达情况相一致.既然Hedgehog信号通路在QBC939细胞中呈高激活状态，那么使用Hedgehog信号通路特异性阻断剂环靶明是否会对胆管癌细胞的生长与增殖、凋亡产生影响呢?本实验观察到，环靶明处理后，QBC939细胞形态学发生了明显的变化:生长减慢、细胞形态受损、细胞变小变圆、细胞间连接减少或消失、部分细胞皱缩、核固缩现象明显、出现较多悬浮的单个细胞.且浓度越高这种变化越明显。MTT的结果则显示，5^-20}mol/I_的环靶明可以剂量依赖性地抑制QBC939细胞的生长·并且10}mo1/I_的环靶明对QBC939细胞的生长抑制作用也随时间的延长而趋于明显。Anncxin}//PI双染法流式细胞术结果提示，随着环靶明药物剂量增加，细胞凋亡率逐渐升高。在药物浓度达到20}Cmo1/L时，促进细胞凋亡的效果最明显。RT-PCR及Western blot结果显示，环靶明作用48 h后，PTCHl}GLIl的mRNA在QBC939中表达下调，尤以10}mol/I、环靶明组为著;PTC'Hl,GI.I1的蛋白表达也明显下调，但5}mol/I、和10 umol/L环靶明组PTCH1,GLI1蛋白表达差异无统计学意义。上述结果提示，HH信号分子对胆管癌细胞的增殖起维持作用，阻断该信号通路可以抑制胆管癌细胞QBC939生长与增殖，并促进细胞凋亡。本实验还发现，表皮生长因子受体(EGFR)在QBC939细胞中呈高表达状态。

在环靶明抑制QBC939细胞增殖的过程中，EGFR蛋白表达也相应下调，并且其下调有明显剂量依赖性，尤以10}}mo1/I、环靶明组为著。RT-PCR检测也显示，EGFR的mRVA在QBC939中表达下调，尤以10}}mo1/I、环靶明组为著。在我们前期的研究结果中已经证实.IiH和EGFR信号通路之间存在一定联系。且均与一些不良预后因素有关。有研究表明，抑制HII信号通路可以使EGFR表达下调，从而抑制细胞增殖，促进凋亡1，由此说明，EGFR很可能是HH信号通路的下游效应分子。这两条信号通路之间的交叉对话(crosstalk)可能对胆管癌的发生发展起着重要作用。本实验结果与其他学者在肝癌、胰腺癌等肿瘤研究中指出的EGFR是HH信号通路下游效应分子相一致。本研究结果表明，HH信号分子对胆管癌细胞的增殖起维持作用，阻断该信号通路可以抑制胆管癌细胞QBC9 3 9增殖，并促进细胞凋亡。EGFR表达下调可能是其介导作用机制之一。HH和EGFR信号途径在胆管癌细胞系QBC939呈活化状态，对胆管癌的发生发展可能起重要作用进一步研究这两条信号通路之间的联系，有助于从发育生物学的角度深人理解胆管癌的起源。通过特异性抑制HH信号传递可以达到分子靶向治疗的目的，而PTCH1,GLI1和EGFR蛋白则可以作为胆管癌早期诊断和预后判断的分子标志物，因此在胆管癌的防治中可望有良好的应用前景。

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