跨膜丝氨酸蛋白酶4对肝细胞癌增殖侵袭作用的影响

跨膜丝氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serine 4,TMPRSS4)是近来发现的11型跨膜丝氨酸蛋白酶家族(T丁sPs)的主要成员之一。TMPRSS4具有典型的丝氨酸蛋白酶的结构特征并具有胰蛋白酶活性m。目前已在包括胰腺癌、肠癌、肺癌、卵巢癌及甲状腺癌等在内的多种肿瘤组织都检测TMPRSS4高表达。研究证实TMPRSS4是促进肿瘤侵袭转移的重要分子1-3。目前国内外尚无TMPRSS4在肝细胞癌(hepatoce11u1ar carcinoma,HCC')表达的研究。为此本研究通过慢病毒转染技术探讨了TMPRSS4表达对HCC增殖及侵袭的影口向。

材料与方法

1.实验材料:主要包括In-FusionT}PCR试剂盒(Clontech公司),Plasmid抽提试剂盒(Promega公司)、RT-PCR试剂盒(大连宝生物技术有限公司)、兔抗人TMPRSS4单克隆抗体(Protein Tech公司)、BCA蛋白浓度试剂盒(碧云天生物技术研究所),DMEM培养基(Gibcobrl公司),Transwell小室(Corning公司)、Matrigel胶(BD公司)全自动紫外可见分析装置(FR-200A，复日公司)。

2.细胞培养:采用肝细胞癌细胞株BEL-7402 0 DMEM培养基(含10%胎牛血清，100 U/m}青霉素和100 Pg/ml链霉素)培养.370C',50o CO孵育每3-}-4 d更换培养基。0.2500胰酶一乙二胺四乙酸<EDTA)消化后1，3传代。

3.重组pGC-FU-TMPRSS4慢病毒载体的构建:通过RT-PCR获得特异性TMPRSS4基因片段，长度约493 by。胶回收纯化后，将片段与载体相接。转化后进行酶切鉴定，约在500 by处可见特异性片段。测序后将所得序列在Blast上进行比对，与原序列一致。将其连接在已酶切的pGC-FU(一)慢病毒上构建pGC-FU-TMPRSS}慢病毒表达载体。细胞分为3组:正常BEL-7402对照组(control);空白载体对照组，即转染空pGC-FU载体的BEL-7402细胞组(pGC-FU);TMPRSS4过表达组，即转染pGC-FU-TMPRSS4载体的BEL-7402组(pGC-FU-TMPRSS4)。

4.RT-PCR检测细胞丁MPRSS4mRNA表达:细胞生长至亚融合状态。PBS冲洗两次。向收集有细胞沉淀的Eppendorf管中加人Trizol，按照说明书提取总RNA。逆转录反应按试剂盒说明书操作，依次加人下列试剂(20川反应体系):4浏5}PrimeScriptT}`Buffer,1}d PrimeScriptTM RT Enzyme Mix,l Icl Oligo dT Primer<50 frmol/I)，1 f}l Random 6 mers(100}mol/I)，1;rg RNA，RNase Free dH}()补足至20川。PCR扩增按照如下步骤进行:预变性950C 15 min，变性94 0C 30、，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，终末延伸72 0C 10 min。共35循环。TMPRSS4上游引物为5'-CCGATGTGT-TCAACTGGAAG-3'，下游引物为5'-CCCATC-CAATGATCCAGAGT-3'0(3-actin上游引物为J‘-UCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3'，下游引物为5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3'。

5.W estern blot检测细胞TMPRSS4蛋白水平[ru:蛋白提取、定量并调整各组总蛋白含量相等，SDS-PAGE电泳和电转移。用封闭液室温下封闭转移后的PVDF膜1h。将PVDF膜放人杂交袋中，加人一抗稀释液稀释的一抗，室温摇动反应1 h,置4℃冰箱过夜。PI3ST洗涤PVDF膜3次，每次15 min。加人封闭液稀释的二抗，室温反应30 min0 PBST洗涤PVDF膜4次，每次15 min0 ECL化学发光检测:PVDF膜置于等量混合ECL中的A液和B液中，室温孵育反应3-}-5 min，暗室曝光显影。

6.MTT实验按照实验流程进行}'}:96孔板每孔加人100浏2000个细胞.在细胞培养箱内孵育48 h。每孔加人10川CCK-8溶液。以加了细胞培养液和CCK-8溶液但没有加人细胞的孔作为空白对照。在细胞培养箱内继续孵育2h。在450 nm测定吸光度，根据吸光度计算细胞相对数量及增殖率。

7.侵袭实验:Matrigel胶a 0c过夜解冻后用无血清预冷的DMEM按1，8稀释。将100川稀释过的Matrigcl胶加人Transwell小室上室，37℃孵育2-}-3}:使其成凝胶状0.2500胰酶-EDTA消化细胞并用不含血清的DMEM重悬细胞，使其浓度为10'一m1在Matrigel胶上加人100川细胞悬液·下室加人600川条件培养液。37 0C,50o CO:培养24 h后取出小室棉签擦净膜上未侵袭的细胞及Matrigcl胶。37℃预温的PhS漂洗，甲醇固定.Giemsa染液染色。切下膜固封于载玻片上，200倍光镜下随机选取5个视野计数，取平均值。每个不同条件的实验重复3次。

8.统计学处理:应用SPSS 13.0统计软件。数据均采用均数士标准差(x.士、)。组间比较采用t检验，频数变量之间比较用丫检验。

结果

1.过表达TMPRSS4慢病毒转染人肝细胞癌细胞株BEI=7402 24 h后，在荧光显微镜下可见转染成功的TMPRSS4过表达BEL-7402细胞(图la)及转染空白载体的BEL-7402细胞(图1b>发出绿色荧光，而对照组BEL-7402细胞无绿色荧光(图lc)

2.RT-PCR结果显示，慢病毒转染后，pGC-FU-TMPRSS4组细胞TMPRSS4 mRNA表达增强(图2),TMPRSS4条带光密度较对照组和pGC-FU组明显增强((1.340士0.198,P}0.05)，而对照组和pGC-FU组中的条带光密度无明显差异(0.363士0.182比0.365士0.171,P}0.05)。说明人肝细胞癌细胞株BEL-7402转染目的基因TMPRSS4成功。

3.Western blo、结果显示，与对照组和pGC-FU组比较，pGC-FU-TMPRSS4组细胞TMPRSS4蛋白表达显著增强，而对照组与pC}C:-FU组TMPRSS4蛋白表达无明显差异(图3)。结果进一步说明BEL-7402细胞成功转染并表达目的基因TMPRSS4。

4.MTT实验结果显示，慢病毒转染后，对照组，pGC-FU组和pGC-FU-TMPRSS4组细胞增殖能力无显著差异(图4,P}0.05)。说明TMPRSS4过表达对BE工一7402细胞株的增殖无显著影响。

5.侵袭实验显示pUC-FU-TMPRSS4组细胞穿过Matrigel胶到达Transwell小室膜背面的细胞数为49.3士7.4，显著高于对照组(23.3士5.时和pGC-FU组(19.3}-3.2)(P}0.05)。提示TMPRSS4过表达后细胞的侵袭能力增强。

讨论

蛋自酶在肿瘤演进中的作用日益受到重视。蛋白酶失调导致的蛋白水解是肿瘤演进的标志之一，而蛋白酶降解细胞基底膜及细胞外基质则是肿瘤转移侵袭过程中必不可少的环节。在这一过程中起主要作用的是金属蛋白酶家族(MMPs)和丝氨酸蛋白酶家族。MMPs家族在肿瘤侵袭转移中的作用已被广泛认识。但是，丝氨酸蛋白酶家族，尤其n型跨膜丝氨酸蛋白酶(I`TSPs)在肿瘤进展中的作用尚未完全揭示。TMPRSS4是最近发现的TTSP、家族中的主要成员之一。其多肤序列包括437个氨基酸，具有典型的丝氨酸蛋白酶的结构特征并具有胰蛋白酶活性。TMPRSS4首先于2000年被发现在胰腺癌组织内高表达。此后，在多种肿瘤组织都检测到高表达，并与肿瘤的侵袭转移密切相关1污我们通过构建TMPRSS4过表达慢病毒载体并转染HCC细胞株，建立了可稳定传代的过表达TMPRSS4的IICC细胞株。我们采用RT-PCR及Western blot检测了对照组、空白载体转染组和TMPRSS4过表达组HCC细胞TMPRSS4 mRNA及蛋白的表达情况。结果显示尽管对照组及空白载体转染组H CC_'细胞TMPRSS4表达明显低于TMPRSS4过表达组细胞，但是仍可检测到TMPRSS4的表达。尽管实验显示‘hMPRSS4表达对HCC细胞的增殖并无显著影响，但是我们发现TMPRSS4过表达组HCC细胞侵袭性显著强于对照组及空白载体转染组HCC细胞的侵袭性。

这一结果说明TMPRSS4是调控HCC细胞侵袭性的重要基因之一。研究显示TMPRSS4可通过诱导上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)而促进肿瘤的侵袭、迁移和转移困。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的复杂过程。在此过程中上皮细胞的极性消失，迁移和运动能力增强，同时伴有上皮细胞的标志丢失，而间质细胞的标志过度表达川。EMT是目前上皮来源的恶性肿瘤发生侵袭转移的重要原因叫。近年的研究发现在肝癌的发生及进展中存在EMT现象，并且与肝癌的侵袭转移密切相关u}z}。我们的前期研究显示，肝癌TMPRSS4过度表达，可抑制E-cadherin的表达及促进N-cadher-in和Vimentin的表达，从而导致肝癌EMT的发生。但是，TMPRSS4诱导肝癌EMT发生的相关信号通路及调节机制目前尚不清楚。为此，仍需进一步明确TMPRSS4诱导EMT及促进肝癌侵袭转移的分子机制，以期找到新的抑制肝癌侵袭转移的治疗靶点，从而提高肝癌的疗效。

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