化疗药物对胃癌CD133+细胞亚群的作用及其对相关凋亡基因表达的影响

胃癌是我国常见的高病死率的恶性肿瘤之-，多数患者确诊时已属中晚期，手术根治率低。化疗仍是中晚期胃癌及术后复发转移的主要治疗力-法之-，但其疗效不甚理想。有文献前期成功分选KATO-III CD133+细胞亚群，鉴定其具有部分“干细胞”样特性，并发挥肿瘤起始细胞(Tumor initiating cells,TICS)的某些作用。研究已证实，胃癌常规化疗药物主要是通过抑制细胞增生和诱导肿瘤细胞凋亡来发挥治疗作用。为进-步观察不同化疗方案对胃癌的抗癌作用，以寻找治疗胃癌的新途径，笔者以CD133'胃癌起始细胞亚群为体外模型，研究其诱导凋亡效应，并对其相关凋亡分子进行初步探讨，以便为胃癌的靶向化疗提供实验依据。

1材料和方法

1.1细胞和主要试剂人胃癌KA TO-III细胞由美国标准生物品收藏中心(American type culture collection，ATCC)提供。胎牛血清购自美国Hyclone公司;ATCC培养液购自ATCC;人表皮生长因子(Epidermal growth factor,E GF)及人碱性成纤维细胞生长因子(b-fibroblast growth factor,bFGF)购白美国PeproTech公司;免疫磁珠细胞分选仪、CD133分选试剂盒购自德国Milte-nvi公司。半定量聚合酶链反应(Reverse transcrip-tion-polymerise chain reaction,RT-PCR)测定试剂盒RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0购自口本TaKaRa公司。所用引物采用以Primer Express 2.0软件设计，并山上海生工生物工程技术服务公司合成。Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)购自美国Cayman公司。

1.2细胞培养及免疫磁珠分选人胃癌KATO-III细胞培养于含20%胎牛血清的ATCC完全培养基中(pH 7.2-7.4，置37℃，5%Co:饱和湿度培养箱中培养。2-3d传代1次。KA-TO-III细胞经0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，收集细胞后调整至1 x 10'/mL,磷酸缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)洗1次，300 p,L缓冲液重悬，按操作指南用MiniMACS分离柱分选，进而分别收集CD133+细胞和CD133-细胞，离心后用无血清含20 n留mL EGF及10 ng/mL bFGF的ATCC重悬行后续实验。

1.3半定量RT-PCR检测相关基因表达所收集细胞经消化后，以Trizol法提取总RNA,取500 ng总RNA逆转录为cDNA，反应体系为42℃30 min,99℃50 min,5 0C 5 min，总量为10 p,L。行PCR反应，CD133上游引物:5-TTACGGCACTC'F-TCACCT-3;下游引物:5-1'A101'CCACAAGCAGCAAA-3;产物长度为172 by，退火温度为57℃。Bcl-2[游引物:5-TTGGATCAGGGAGI'TGG}}AG-3;下游引物:5-TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3;产物长度为295 bp,退火温度为57 0C 0 BAX上游引物:5-AAGAAGCT-GAGCG.AGTGT-3;下游引物:5-GGAGGAAGTCCAAT-GTC-3;产物长度为265 by，退火温度为57℃。GAP-DH作为内参，仁游引物:5-ACGGATTTGGTCGTA'I'T-GGGCG-3;下游引物:5-CTCCTGGAAGATGGTGAT-GG-3;产物长度197bp，退火温度为55℃二取5 p,L CD133 PCR产物，2 p,L GAPDH PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测并图像保存，CD133,Bcl-2,BAX及GAPDH扩增重复3次，取平均值。应用凝胶成像系统及凝胶图像分析软件进行半定量分析目的产物与对应GAPDH产物的灰度值比值。目的mRNA表达水平以目的产物mRNA扩增条带密度灰度值与GAP-DH mRNA扩增条带密度灰度值比值表示。

1.4在抗肿瘤药物作用下的分选后细胞生长抑制比率的比较(CCK-8法)分选后CD133十组及CD133-组细胞重悬于含20 ng/ml}FGF及10 ng/mT,bFGF的尤(fll清A'1'C C:，稀释为1 x 10`}/mI，以每孔200 O,L接种于96孔板，设置3个空自对照组，并设置1个调零对照组(无细胞的A'l'C:C)分别加人不同浓度的5-FUSS-20 mM)、顺铂(5-20 mM)及VP-16(100-400},M);每-浓度设3个复孔培养12 1:后，用GCK-8法测定细胞的耐药情况，以450 n m的吸光度A值量化活细胞数，比较3种药物对细胞生长的抑制率情况计算抑制率=(空白孔/I值-实验孔4值-调零孔A)x 100}h/(对照孔1值-调零孔1)。

1.5半定量RT-PCR检测凋亡相关基因分选后CD133+组及CD133-组细胞重悬于含20 ng/mT.ECF及10 ng/rnT,bFGF的无而_清ATC C,稀释为1 x 10'/m1.，以每孔2 mL接种于6孔板分别加人5-FU(10 mM),)l匝铂(10 mM)及}'1'-16(200}M)培养12 h后，收集CD133十组及CD133-组细胞，行RT-PC R，退火温度(T}cl-2为53 0C,I}}为53 0('9 CAPDTT为55 0C半定最分析目的产物，J对、认GAYDH产物的灰度值比值，实验重复3次取平均位-1.6统计学处理采用Sl-'S}13.0统计软件对数据进行处理.实验结果以(均数士标准差)表示，对CD133十细胞组和CD133-细胞组的生长抑制比率以及未应用抗肿瘤药物的凋亡相关基因的mRN}电泳条带相对灰度值等的重复计量数据采用单因素方差分析(one-vav;ANO-V-1检验))、认用抗肿瘤药物12 h后的凋亡相关基因的mRNA电泳条带相对灰度值的比较采用精确Fisl。检验.<0.05为差异有统计学意义

2结果

2.1纯化、分离胃CD133十和CD133-细胞亚群K}TO-班细胞磁珠分选纯化后，经流式细胞仪分析结果显不:分选后CD 133十组细胞听得细胞CD133十表达率为90%以_L，台盼蓝染色未见死细胞，显示应用}'lini't1-ACS分选技术基本不影响细胞活性，能满足后续实验要求、分选后的两组细胞在含FtsF及hF(}F的无血清1TC C培养液中培养1周后，半定最RT-PCR法测定CD133组CI)133 mR\}表达为(0.789士0.0214明显高于CD133-组(0.216士0.0340)(P=0.035 

2.2化疗药物对胃癌CDI33+细胞亚群形态学改变的影响5-FU、顺铂及VR 16分别作用12 h后，CD133+细胞亚群及CD133-细胞亚群均开始出现凋亡的形态学改变，48 h凋亡细胞增多，并有部分细胞死亡。在浓度为5-20 mM的5-PU或顺铂的作用下，或100 400}AT的}l'-16作用下，随着浓度增加，细胞凋亡数增多而浓度大于20 mM的5-FU或顺铂的作用卜，或400 SAT的V'P-16的作用下，细胞以坏死为主〔〕光镜下观察:都有细胞核固缩、染色质凝集及核碎裂发牛，无论是5-I'L或顺铂作用下，还是VP-l 6作用下，二组中的死亡细胞在形态上则无显著差异(图1)

2.3 5-FU、川页铂及VP-16对胃癌CD133+细胞亚群耐药能力影响与未经药物处理的对照组比较，经不同浓度化疗药物处理的CD133和(:D133-细胞生长均受到不同程度的抑制。增生抑制作用随时间延长和浓度提高而增强药物作用12 h后，CD133组在各组药物中抑制比率较CD133-组明显降低，差异有统计学意义(表1)抑制比率随药物浓度增倍也相应增加、〕相差显微镜下观察，各组CD133十细胞和CD133-细胞在3种化疗药物作用下都有核固缩、核碎裂发生，形态上则尤明显差异

2.4 5-FU,JII页铂及VP-16对胃癌CD133+细胞亚群中Bcl-2及BAX mRNA的影响半定最RT-PC R检测凋亡相关基因的:nRN,表达3种抗肿瘤药物作用12h后，CI>133十细胞组和CD133细胞组中凋亡抑制因子Bcl-2 mR}1A相对-灰度值表达降低，凋亡囚子BAX mR1V1相对灰度值表达升高;CD133十组Bcl-2 mRVA相对灰度值明显高J=CD133-组，而在I3Ah rnR}''A相对灰度值的表达发现，CD133+组中灰度值显著低于CD133-组中灰度值

3讨论

CD133/prominin-1最早作为-种分离CD34十造血祖细胞的细胞表}自丁标志物被发现4，随着对其研究深人，证实CD133的表达会随着细胞的分化而迅速厂调，该特征使其或可成为f-个独特的分离和鉴定干细胞和祖细胞的分子标记s-e本研究组前期发现，高分化胃癌细胞株K1T0-III中CD133mRi及蛋自表达水平高于其他分化程度胃癌细胞株，分选后的GD133+细胞业群多呈悬浮生长，在含血清的培养液中CD133标记易分化，较CD133-细胞有史强的增生潜能，由此表明，CD133+可能代表了具有独特的TICS特征的-群亚群细胞肿瘤化疗持续应用的障碍之-是肿瘤细胞耐药睦的产生或肿瘤细胞对-抗肿瘤药物的不敏感性未治愈或复发后的肿瘤对已应用过的或从未应用过的药物不敏感或产生耐药，从而使肿瘤治疗的生存率难以获得显著提高。TICS-般处于静止期，通过DNA自我修复能力和ABC转运蛋白[-种运输ATP酶transport(ATPase),属于-庞大而多样的蛋自家族」而获得的与生俱来的对抗化疗药物的不敏感性而且这种不敏感性在多种结构和作用机制迥异的抗癌药物间具有交叉不敏感性二另外，长期暴露于辐射和/或致癌物后，TICs与它相近的子代细胞可通过点突变、基因激活或基因扩增等出现新的耐药性。大量实体肿瘤中1'ICs研究表明，这类细胞区别于普通成体干细胞，其对化疗药物的耐受性远较处于快速增生期的其他肿瘤细胞强，其与它相近的子代细胞也可在许多化疗后肿瘤复发的患者体内增生形成多药耐药细胞群”。

而且，参与细胞凋亡的，如bcl-2基因、BAX基因、核转录因子KB(NF-KB)、突变p53基因及c-myc基因等都参与了肿瘤细胞耐药，部分基因在TIC、中具有高表达水平I}z-is。这种特点可能是导致肿瘤化疗失败、疾病复发及难以根治的主要原因之-。目前，化疗药物根据对细胞增生周期的作用不同进行分类:细胞周期(时相)特异性药物(Cell cycle specific:agents,CCSA)是指仅对增生周期的某个时相敏感而对CO期细胞不敏感的药物，代谢类药物氟尿嚓陡和生物碱药物VP-16都属于细胞周期特异性抗肿瘤药物。前者作用于细胞分裂增生各个时相，后者则于晚S期或G2期发生功效。顺铂则为细胞周期非特异性药物，作用于增生或非增生细胞。通过3种药物敏感性实验发现，CDI33十细胞亚群抑制率较CD133-细胞亚群细胞有-定程度的下降，抑制率差异有统计学意义这提示，作为T1Cs的CD133+细胞亚群有-定的抗药性，我们正对其具体机制进行更深人的研究。诱导肿瘤细胞凋亡常伴随相关凋亡基因的改变。细胞凋亡是受基因调控的，有众多的基因参与凋亡过程，其中p53,Bcl-2,c-myc被认为具有重要的调节作用。Bcl-2基因是重要的凋亡抑制基因，部分化疗药物通过下调肿瘤细胞Bcl-2的表达而诱导凋亡’时，作为促进凋亡的基因，B 3k可与Bcl-2结合形成异源性二聚体’6，从而取消BCl-2基因的抗凋亡作用，促进细胞凋亡。本

研究通过3种化疗药物干预，CD133细胞亚群及CD133-细胞亚群中凋亡抑制因子Bcl-2 mP}NA表达降低，凋亡因子BAX mRNA表达升高。与CD133-细胞亚群相比，CD133+细胞亚群中的Bcl-2和B AX这两个凋亡相关因子表达变化更为显著。由此可见，CD133+细胞亚群或作为处于静止期的TICs，通过过高表达抑制凋亡基因、过低表达促进凋亡基因而产生耐药抵抗化疗。随着TICS理论的丰富和发展，对CD133十在胃肠道肿瘤中的表达情况和其意义的了解，必然会加深对胃肠道肿瘤发生发展机制的了解，并可为将来胃肠道肿瘤的靶向治疗提供新的方向。

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