半胱氨酸蛋白酶抑制剂减少大鼠脑缺血模型Calpain的表达

　　作者：王宇卉 夏春林 邵福源　　作者单位： 200125 上海 上海市浦南医院神经内科　　215007 苏州大学医学院神经细胞生物学研究室　　200003 上海 第二军医大学长征医院神经科

　　【摘要】 目的 研究半胱氨酸蛋白酶Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CMK及Calpain抑制剂ALLN干预治疗对大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型Calpain表达的影响。方法 大鼠随机分为经左侧侧脑室注射Ac-DEVD-CMK(DEVD组)、ALLN(ALLN组)、二者联合(DEVD+ALLN组)或溶剂二甲基亚砜组(DMSO组)，以及缺血对照组(MCAO组)，诱导左侧MCA缺血2h，再灌注24或48h;再灌注24h进行TTC染色观察梗死灶的形成情况;分别通过原位杂交和免疫组化技术检测鼠脑中Calpain mRNA及活性蛋白的表达。结果 DMSO组的各项指标与MCAO组差异无显著性;DEVD组或ALLN组缺血侧脑中Calpain mRNA及活性蛋白的表达均明显减少，二者合用作用最强。结论 Caspase-3与Calpain均在缺血性脑损伤中起重要作用，针对它们进行治疗干预具有潜在的临床应用价值。

　　关键词 脑缺血 半胱氨酸蛋白酶 Caspase-3 Calpain 抑制剂 干预

　　Effects of cysteine protease inhibitor on calpain expression in rat brains subjected to transient focal cerebral ischemia

　　Wang Yuhui,Xia Chunlin,Shao Fuyuan

　　Department of Neurology,Pu’nan Hospital of Shanghai,Shanghai 200125.

　　【Abstract】 Objective To study the effects of cysteine protease caspase-3 inhibitor Ⅲ Ac-DEVD-CMK or calpain inhibitor ALLN on calpain expression in rat brains subjected to transient focal cerebral ischemia.Methods Rats were randomized to receive intracerebraventricle injection of Ac-DEVD-CMK(group DEVD),ALLN(group ALLN),or both(group DEVD plus ALLN),or vector DMSO(group DMSO),and then were induced to ischemia by 2 hours of left middle cerebral artery occlusion(MCAO),followed by 24 or 48 hours of recirculation.Infarct zones were confirmed by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining at 24 hours of recirculation,in situ hybridization and immunohistochemistry were performed in rats brain sections to detect calpain expression at the mRNA level,and the active protein level separately.Results Pretreatments with caspase-3 or calpain inhibitor decreased the calpain expression in the ipsilateral brain after transient focal ischemia,in a synergic manner.Conclusion Both caspase-3 and calpain might play an important role in ischemic brain damage，and the use of specific caspase-3 or/and calpain inhibitors might be of potential therapeutic utility in ischemic injuries to the human brain.

　　Key words cerebral ischemia cysteine protease caspase-3 calpain inhibitor intervention

　　缺血性脑血管病是死亡和功能残障的主要病因之一，迄今仍缺乏有效的治疗手段。随着对缺血性脑损伤分子机制的深入了解，发现半胱氨酸蛋白酶，尤其是胱天蛋白酶-3(Caspase-3)及钙激活中性蛋白酶(Calpain)，在缺血性脑损伤中起重要作用[1,2]。笔者业已发现，Caspase-3抑制剂对缺氧/复氧神经元有保护作用[3];大鼠MCAO/再灌注模型中，缺血侧大脑皮质出现单、双链DNA断裂[4]，Caspase-3与Calpain mRNA及活性蛋白表达增加[5]，Caspase-3或(和)Calpain抑制剂预处理可减轻鼠脑缺血后的DNA损伤与Caspase-3表达[6，7]。本文通过单用或联合应用Caspase-3及Calpain抑制剂对大鼠局灶性MCA缺血/再灌注模型进行干预，研究实验动物脑中Calpain mRNA及活性蛋白的表达，进一步探讨Caspase-3及Calpain抑制剂在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康成年SD大鼠，雌雄不拘，体重250～280g，由苏州大学实验动物中心提供。随机分为下列几组：(1)缺血对照组(MCAO组);(2)Ac-DEVD-CMK治疗组(DEVD组)：手术前左侧侧脑室注射Ac-DEVD-CMK 2μg(溶于20ml/LDMSO 2μl中);(3)ALLN治疗组(ALLN组)：手术前左侧侧脑室注射ALLN 4μg(溶于DMSO 2μl中);(4)DEVD+ALLN治疗组：手术前左侧侧脑室注射DEVD 2μg+ALLN 4μg(溶于DMSO 2μl中);(5)DMSO对照组：手术前左侧侧脑室注射DMSO 2μl。每组再进一步分为缺血2h再灌注24h和48h组，每组均5只大鼠(n=5)。

　　1.2 给药方法 干预治疗组大鼠在手术前经36g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，俯卧固定于脑立体定位仪上，暴露前囟，经左侧侧脑室缓慢注射不同剂量的抑制剂后，即进行造模手术。

　　1.3 MCAO模型的建立及组织切片的制备 大鼠左侧MCAO/再灌注模型的建立参照Belayev等改良的Longa线栓法[4]。

　　1.4 鼠脑大体形态观察及TTC染色 左侧MCA缺血2h再灌注24h后处死大鼠，断头取脑，观察鼠脑大体形态。去除小脑和脑干部分后，放置于0～4℃的生理盐水中，10min后取出，按2mm厚度自后向前连续做6个脑组织冠状切片，立即置20ml/L TTC/磷酸缓冲液中，避光、37℃恒温孵育30min，染色后置40g/L多聚甲醛/PBS中固定6h，观察脑呈色情况并拍照。

　　1.5 Calpain mRNA的表达(原位杂交) Ⅰ型Calpain mRNA原位杂交试剂盒购自博士德公司，按说明书进行操作[5]。光学显微镜下观察，阳性细胞为棕黄色染色。用PBS代替杂交探针作为阴性对照片，其余步骤相同。

　　1.6 Calpain活性形式蛋白质的表达 CalpainⅠ多克隆抗体均针对其活性形式蛋白，购自美国Santa Cruz公司，用2% BSA/PBS 1∶200稀释。二抗山羊抗大鼠IgG及SABC免疫组化染色试剂盒购自博士德公司。按说明书进行操作[5]。光学显微镜下观察，阳性细胞为棕黄色染色，阴性对照片用PBS代替一抗，其余步骤相同。

　　1.7 统计学处理 由对实验不知情者在高倍镜(×400)下分别计数相邻脑片中缺血侧及非缺血侧相同部位的Caspase-3 mRNA及活性蛋白阳性细胞数，实验所得数据以均数±标准差(±s)表示，经SSPS 10.0统计软件包用方差分析(ANOVA)进行分析处理，两两比较采用LSD Post Hoc检验，差异有显著性(P<0.05)。

　　2 结果

　　2.1 鼠脑大体形态及TTC染色结果 缺血2h再灌注24h，观察鼠脑，见MCAO组大鼠缺血侧脑组织肿胀较明显，溶剂DMSO组的大体形态与MCAO组相似，而抑制剂ALLN组或DEVD组尽管也有不同程度的脑组织肿胀，但较缺血对照组为轻，ALLN+DEVD组脑组织肿胀不明显。TTC染色后，在左侧MCA供血区可见明显的梗死灶形成，证实模型制作成功。粗观发现DSMO组的梗死灶与MCAO组相似，治疗干预组的梗死灶小于缺血对照组，联合治疗组梗死灶最小。

　　图1 缺血/再灌注不同时间各治疗组鼠脑中Calpain mRNA的表达(略)

　　注：与DMSO组相比，*P<0.05;与DEVD+ALLN组相比，#P<0.05

　　图2 缺血/再灌注不同时间各治疗组鼠脑中Calpain蛋白质的表达(略)

　　注：与DMSO组相比，*P<0.01;与DEVD+ALLN组相比，#P<0.05

　　2.2 不同干预治疗后鼠脑中Calpain mRNA的表达 MCA缺血2h再灌注24h及48h，各干预治疗组大鼠缺血侧脑中Calpain mRNA的表达不同程度地增强(见图1)，以再灌注24h最为显著。溶剂DMSO对照组的表达量与MCAO组相似;各治疗组大鼠缺血对侧脑中的mRNA表达无明显增加;Calpain抑制剂ALLN治疗后，缺血侧Calpain阳性细胞数明显减少;而用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CMK治疗的大鼠，缺血侧脑组织中的Calpain阳性细胞数的减少也很明显，再灌注后24h作用最强;两种抑制剂合用后可使缺血侧脑组织中Calpain的表达更进一步减少，分别与单用组相比，P<0.05;但各治疗组缺血侧脑中的Calpain表达仍高于对侧。

　　2.3 不同干预治疗后鼠脑中Calpain活性蛋白的表达 各组大鼠脑中Calpain活性蛋白的表达模式与其mRNA表达相似：MCA缺血2h再灌注24h及48h，各干预治疗组大鼠缺血侧脑中Calpain活性蛋白质的表达不同程度地增强(见图2)，也以再灌注24h最为显著。溶剂DMSO对照组的表达量与MCAO组相似;各治疗组大鼠缺血对侧脑中未发现明显的Calpain蛋白活化;ALLN组缺血侧Calpain阳性细胞数明显减少;而DEVD组大鼠缺血侧脑组织中Calpain阳性细胞数的减少也很明显，再灌注后24h作用最强;DEVD+ALLN组缺血侧脑组织中Calpain的表达更进一步减少，分别与单用组相比，P<0.05;但各治疗组缺血侧脑中的Calpain表达仍高于对侧。

　　3 讨论

　　研究发现，半胱氨酸蛋白酶家族成员Caspases与Calpain共同参与了缺血性脑损伤过程。在以往的研究中，笔者证实细胞凋亡机制参与了大鼠大脑中动脉缺血/再灌注损伤过程，出现单链和双链DNA断裂，主要位于梗死周围的半影区，单链损伤出现相对较早[4]，缺血侧脑组织Caspase-3、Calpain mRNA及活性蛋白的表达增加[5，6]。在缺血前用Caspase-3抑制剂Ⅲ Ac-DEVD-CMK和(或)Calpain抑制剂ⅠALLN治疗后，缺血侧脑组织中Klenow及TUNEL阳性细胞数均较未治疗组显著减少，此两种抑制剂之间有一定的协同作用[6，7]。本研究证实，缺血前用上述两种抑制剂可减少缺血脑组织Calpain mRNA及活性蛋白的表达，两种抑制剂之间有协同作用，此一结果与笔者在离体条件下进行的研究结果一致[3]，进一步证实在缺血性神经元损伤过程中，半胱氨酸蛋白酶Caspase-3与Calpain均起重要作用，抑制它们的活性可产生明显的神经保护作用[8，9]。

　　在多种病理情况下，Caspase-3及Calpain共同被活化，此两种蛋白酶之间有复杂的相互作用，除了可同时裂解一些公共底物，如细胞骨架蛋白等而协同促进细胞死亡外，它们还可裂解一些对彼此调节很重要的蛋白质，如Caspase-3可降解Calpain的内源性抑制剂Calpastatin，从而使Calpain活性增强;而Calpain也可切割Pro-Caspase-3和Pro-Caspase-9等，促进Caspase介导的细胞凋亡[2]。因此，同时抑制这两种蛋白酶应可产生一定的协同作用。笔者也发现，Caspase-3抑制剂与Calpain抑制剂之间有协同作用，进一步证实以上观点，并支持这两种蛋白酶在缺血性脑损伤中均起重要作用，它们之间存在相互作用。这一结果同Rami等在用Wistar大鼠短暂前脑缺血模型进行的研究结果一致，他们发现缺血60min后分别用Caspase-3抑制剂、Calpain抑制剂均可减轻缺血后的神经元损伤，二者合用有协同作用[10]。

　　Ac-DEVD-CMK是一种强力的、细胞渗透性的不可逆性Caspase-3抑制剂，可通过使Caspase保守序列QACXG中的半胱氨酸残基烷化而使酶的活性位点不可逆性失活，对Caspase-6、-7及-10也有一定的抑制作用。笔者在体外研究中发现，用1μM的Ac-DEVD-CMK预处理后，对缺氧海马神经元的保护作用很弱，随剂量的增加，保护作用也逐渐增强，但笔者未能进一步研究高峰作用的剂量为多大[3]。本研究也发现，缺血前脑室内注射Ac-DEVD-CMK可减轻缺血性脑损伤，进一步支持在缺血性神经元损伤中，抑制Caspase-3的活性可能成为一条新的治疗途径。

　　Ac-DEVD-CMK治疗的时间窗与Caspase活化的时间有关。Fink等研究发现，在小鼠短暂MCA缺血(30min)后，脑室注射zDEVD-fmk 480ng有明显的神经保护作用，可减轻神经功能损伤程度，减小梗死灶，减少凋亡细胞数。在血流恢复后9h注射仍有效，但在12h注射则无效。这一9h的治疗窗与Caspase的活化时间有关。因此，在Caspase活化之前给予zDEVD-fmk治疗可阻止缺血性损伤的发展，超过9h后给药，由于Caspase级联已经激活，其下游的效应因子作用于多种底物，使之产生不可逆的降解，因而细胞死亡已经与Caspase失去偶联，即使抑制了Caspase的活性，也不能改变这些不可逆过程。zDEVD-fmk对Caspase-3样蛋白酶活性的抑制持续时间较长，可能是由于该抑制剂对Caspase-3的活性位点半胱氨酸硫磺基的不可逆烷化所致。但抑制Caspase-3样蛋白酶的活性并不能完全逆转神经元的死亡，提示神经元死亡是由多种因素共同参与的复杂过程，而Calpain可能就是其中重要的因素之一[2]。研究发现全脑缺血及局灶性脑缺血后Calpain活性增强[5，10]，因此，抑制Calpain可能延缓严重受损神经元的死亡。ALLN是一种有效的选择性Calpain抑制剂，主要作用于Ca2+结合位点，是一种膜通透性的活性位点抑制剂，Markgraf等用Calpain抑制剂MDL 28170治疗大鼠局灶性MCAO(180 min)再灌注损伤，证实Calpain抑制剂有神经保护作用，并有6h的治疗窗，作用呈剂量依赖性。本研究也证实ALLN可减少大鼠脑缺血后Caspase-3的表达，并与Ac-DEVD-CMK有协同作用。关于ALLN对Caspase-3的影响，目前未见相关报道，推测可能是由于其抑制了Calpain的活性，而间接引起Caspase-3活性的降低，从而提示Calpain位于Caspase-3的上游，对此尚有待进一步研究。

　　参考文献

　　1 Neumar RW.Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury.Ann Emerg Med,2000,36:483-506.

　　2 Yamashima T.Implication of cysteine proteases calpain,cathepsin and Caspase in ischemic neuronal death of primates.Prog Neurobiol,2000,62:273-295.

　　3 王宇卉,邵福源，夏春林,等.海马神经元缺氧/复氧后Caspase-3活性的变化.第二军医大学学报,2002,23:1214-1217.

　　4 王宇卉,邵福源，夏春林,等.大鼠局灶性脑缺血/再灌注后单、双链DNA断裂的实验研究.中国临床神经科学,2002,10:345-348.

　　5 王宇卉,邵福源,夏春林,等.大鼠短暂局灶性大脑中动脉缺血/后calpain的表达.中国神经科学杂志,2003,19:151-155.

　　6 王宇卉,邵福源,夏春林,等.半胱氨酸蛋白酶抑制剂对大鼠脑缺血模型DNA损伤的实验研究.中国临床康复，2003,7:1064-1065.

　　7 王宇卉,夏春林,邵福源.半胱氨酸蛋白酶抑制剂减少大鼠脑缺血模型Caspase-3的表达.中国临床神经科学,2004,12:245-249.

　　8 Loetscher H,Niederhauser O,Kemp J,et al.Is Caspase-3 inhibition a valid therapeutic strategy in cerebral ischemia? Drug Disc Today,2001,6:671-680.

　　9 Li H,Colbourne F,Sun P,et al.Caspase inhibitors reduce neuronal injury after focal but not global cerebral ischemia in rats.Stroke,2000,31:176-182.

　　10 Rami A,Agarwal R,Botez G,et al.μ-Calpain activation,DNA fragmentation,and synergistic effects of Caspase and calpain inhibitors in protecting hippocampal neurons from ischemic damage.Brain Res,2000,866:299-312.