结核分枝杆菌融合抗原38F和64F诊断活动性肺结核的价值

近年来TB又死灰复燃,成为威胁人类健康的主要杀手。全球每年因TB死亡约200万例患者,每年约有800万例新发TB患者。我国是全球结核病高负担国家之一,TB患者数量位居世界第二,而Mtb感染人数则位居世界第一。因此,加强Mtb感染的实验室诊断,早期筛查出潜伏性Mtb感染者和活动性肺结核患者,已成为当前控制Mtb感染的重中之重。

在我国,约80%的肺结核患者分布在经济不发达的中西部地区和农村。肺结核的诊断依然依赖于直接痰涂片抗酸染色显微镜检查和胸部X线摄片检查,急需快速、敏感、特异、简便的方法,还要在敏感度、特异度、可行性、成本-效益等方面实现兼顾和平衡。目前临床上应用的结核病筛查方法除了现有的PPD试验、痰涂片与痰培养外,结核病血清学诊断技术因其固有的优势,如操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊仪器等,越来越多地发挥重要的作用。虽然国际上现有商晶化Mtb抗体检测试剂缺乏足够高的敏感度和特异度,致使WHO不推荐使用此类试剂进行TB的诊断,但是对于TB大规模筛查及菌阴结核病的诊断而言,血清学诊断试剂仍然是优选检测方法。进一步提高血清学试剂的敏感度和特异度,研制出诊断性能更高的血清学试剂是重要的发展方向。由于结核病患者遗传背景、免疫功能和接受的治疗不同,导致机体对Mtb抗原识别存在差异,表现出不同类型的抗体谱,所以采用多种抗原联合检测多种类型抗体(冶G、IgM和IgA)无疑有助于提高结核病患者的检出率。

课题组在先前的研究中成功地构建了Mtb抗原优势肽段融合抗原38F和64F,并且初步建立了IgG抗体的ELISA检测方法。本研究将进一步评价所构建的Mtb抗原优势肽段融合抗原38F和64F在活动性肺结核患者血清IgG、IgM和IgA抗体联合检测中的应用价值。

对象和方法

1.血清来源:223例肺结核患者来自天津市海河医院和北京市朝阳区疾病预防控制中心,全部为连续纳入的临床新近诊断的活动性肺结核患者,未合并感染HⅣ,未接受抗结核治疗或者治疗时间不超过2周。其中第一组为痰涂片和痰培养共同阳性患者(86例);第二组为痰涂片阴性且培养阳性患者(51例);第三组为痰涂片和痰培养共同阴性患者(86例)。94份健康对照血清样本来自于健康献血员,无临床症状,未感染其他疾病。

2.融合抗原的制各:涵盖Mtb7种特异性抗原的抗原优势肽段融合抗原38F(38KESAT6-CFP10)和64F(Mtb8,⒋MPT64-Mtb16,⒊Mtb8)为实验室先前制各,其制各方法参见文献。

3.ELISA法检测血清标本中的IgG、IgM和IgA抗体:(1)将制备好的融合抗原38F和64F以。2:1的比例混合,包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液,pH9,6)稀释,每孔0。45ug抗原包被96孔酶联板,4℃过夜,洗板2次,每次1min。(2)1%牛血清白蛋白(BSA)室温封闭4h,拍干。(3)新鲜血清样本用稀释液按1:10稀释加人96孔酶联板,37℃孵育30min,洗板5次,每次1min。(4)分别加人抗人IgG、抗人IgM和抗人IgA酶结合物,37℃孵育20血n,洗板5次,每次1min。(5)将显色试剂A与显色试剂B按照1:1的比例混合后加人各孔:37℃孵育10min,加入终止液终止显色,在酶标仪上检测样本的吸光值(A4∞rul.值)。

4.统计学分析:运用GraphP猁P⒒sm4软件对检测结果进行彦检验,以P<0.05为差异有统计学意义。绘制ROC曲线,判断ctlt oⅡ值(临界值),≥cut df值判定为阳性,(ct1t off值判定为阴性,并计算敏感度和特异度。

结果

223例活动性肺结核患者的ELISA检测结果见表1和图1~9。第一组患者86例,其中IgG、IgM和IgA检测阳性患者数分别为61、21和25例,检出率分别为70.93%(61/86×彦=10.13,P<0。00D、24.42%(21/86)(彦=11.50,P(0,00D和29.07%(25/86)(r=5,622,P(0,00D(图2),IgG、IgM和IgA联合检出率为79.07%(68/86)。第二组患者51例,IgG、IgM和IgA检测阳性患者数分别为23、15和5例,检出率分别为45.10%(23/5D(彦=7.738,P<0.001)、29.41%(15/51)(r=10.540,P<0.001)和9,80%(5/51)(莎=3.332,P<0.001)(图5),IgG、IgM和IgA联合检出率为62.75%(32/51)(∠=14,650,P(0.001)。第三组患者86例,IgGJgM和IgA检测的阳性患者数分别为狃、20和25例,检出率分别为51.16%(44/86)(∠=11.14,P<0.001)、23.26%(20/86)(莎=9,907,P(0.00D和29,07%(25/8ω(莎=8.597,P<0。001)(图8),IgG、IgM和IgA联合检出率为69.77%(60/86×莎=9.214,P(0,001)。用所构建的融合蛋白38F和64F对三组患者进行IgG检测,所形成的ROC曲线下面积(AUC)为0.8182(图3),检测总的敏感度为s7.40%(128/223)(彦=7,229,P<0。0OD(图1,表2)。相对于IgG的检测,IgM的检测的AUC为0.70⒏(图6),检测的总敏感度为28.70%(64/~9~93)(∠=4.370,P<0,00D(图4,表2)。IgA的检测的AUC为0,6053(图9),检测总的敏感度为24,66%(55/223)(彦=2.790,P(0.05×图7,表2)。IgG、IgM和坨A检测的特异度均为90.43%(85/94×彦=10.840,P<0,001),联合3种抗体检测,特异度略有所下降,为89.36%(84/94)(莎=10,790,P<0.001)。

综合三组样本的检测结果(表3),IgG、IgM和IgA联合检出率为71.75%(160/223)。结合临床细菌学检测结果进行分析,发现单独痰涂片检出率为38.57%(86/223),血清学与痰涂片方法联合检出率可提高为79.82%(178/223)(莎=7.509,P<0.00D。单独痰培养检出率为61.43%(137/223),血清学与痰培养方法联合检出率增加为88,34%(197/223)(彦=11.72,P<0.001)。因此,血清学与细菌学检测方法联合应用诊断结核病可以显著提高检出率。

讨论

近年来,结核病疫情非常严重,敏感度高、特异度好且简便快速的诊断方法对于结核病的防控具有重要意义。血清学诊断在结核病高负担的发展中国家是结核病诊断的重要方法之一E衽彐。大量研究结果显示,单独任何一种抗原均无法检出全部结核病患者,仅部分患者存在抗体反应。因此,采用多种抗原联合检测结核病患者提高检出率,已经成为诊断领域内的共识。

本研究中所采用的融合抗原38F和64F涵盖7种Mtb抗原。38kDa抗原是目前商品化试剂盒中使用最广泛的抗原之一,研究报道该抗原检测的敏感度为16%~20巧。ESA孓6和CFR10也广泛应用在结核病诊断中,ESA孓6和CFR10是Mtb分泌的两种小分子蛋白,由RD1区的基因编码,它们均能诱导机体产生体液免疫反应和特异性细胞免疫反应,产生高水平IFN。MPT64编码基因位于RD2区,RD2区为BCG与Mtb H37Rv基因相比的16个丢失区之一。该抗原具有很强的免疫原性,只存在于Mtb中,在肺外结核病患者中的检测效果良好,并且能够区分出Mtb感染者和BCG接种人群。TB16,3抗原对结核病患者诊断的敏感度为46%~98%,特异度为97%,并且能够识别出超过85%以上的Mtb与HⅣ共感染患者。Mtb8。4是一种免疫反应T细胞抗原,在对潜伏性Mtb感染患者的诊断方面可以发挥重要作用Ⅱ□。Mtb8可能是Mtb菌壁相关转运蛋白,对细胞内抗原的定位、抗体的产生起到辅助作用。在已成功构建的Mtb抗原优势肽段融合抗原38F和64F基础上,本研究主要探讨了融合抗原在活动性肺结核患者体内IgG、IgM和IgA检测中的应用,以及与细菌学诊断方法联合应用的诊断价值。

首先,本研究中所构建的融合抗原38F和64F可以分别用于检测IgG、IgM和IgA抗体。从实验结果可以看出,对于三类活动性肺结核患者,均可以检测出3种类型的抗体。在三类患者中,IgG抗体的阳性率均显著高于IgM和IgA抗体的检出率,这可能是由于患者感染Mtb后,其发病阶段主要产生的是IgG抗体,而IgM抗体是早期感染产生,对早期感染的结核病患者的阳性检出率较高,但是由于发现不及时,不能迅速地对患者进行诊断,很可能错过结核病患者血清中IgM抗体检测的最佳时期。IgA是一类哺乳动物体内产生的比较丰富的免疫球蛋白,其产生于胸膜腔,主要集中在浆细胞黏膜表面分泌。目前,已经证明在结核病患者血清中可以检测到IgA抗体,但是检出率比较低,可能本身在患者体内的阳性率就比较低。研究结果表明,结核病患者血液中的IgA抗体长期存在,与Mtb感染的时间无关。同时有报道显示在HIV与Mtb双重感染的晚期患者中IgA在血清中的含量则明显土曾力。

本研究对三组患者进行IgG、IgM和IgA检测的结果显示,第一组患者的IgG检出率为70.93%(61/86),明显高于第二组的45.10%(23/51)和第三组的51。l⒍%(4荃/86);第二组患者的IgM检出率为29.咀%(15/51),高于第一组的24.绲%(21/86)和第三组的23.26%(20/86);而第二组患者的IgA检出率为9.80%(5/51),显著低于第一组和第三组的检出率,均为29.07%(25/86)。从以上结果可以看出,不同组活动性肺结核患者体内产生的IgG、IgM、IgA3种不同类型抗体水平并不相同,其具体规律还需要更加深入地研究。

其次,本研究的结果也证明了在结核病患者体内产生的IgG、IgM和IgA抗体具有互补性,联合检测3种抗体可以显著提高检出率,减少漏诊的可能性。另一方面,进一步研制可以同时检测多种类型抗体的双抗原夹心检测试剂,以提高检出率是下一步工作的发展方向。

第三,从本研究结果还可以看出,血清学检测可以作为细菌学检测的有效补充,联合应用血清学检测和细菌学检测可以显著提高检出率。单独血清学检测检出率为71.75%(160/223),单独痰涂片检测的检出率仅为38.57%(86/223),痰培养检测的检出率为61.43%(137/223),联合应用血清学和痰涂片检测,检出率可以提高至79.82%(178/223);而联合应用血清学和痰培养检测,检出率可以提高至88.34%(197/”3)。尤其是我国结核病菌阴患者达70%以上,结核病血清学检测作为结核病菌阴患者的辅助诊断手段之一依然有存在的必要。

综上所述,所构建的融合抗原38F和64F可以成功检测活动性肺结核患者体内的IgG、IgM和IgA3种类型的抗体,并且提示了对多种类型抗体联合检测,可提高活动性肺结核患者的检出率。但是,结核病血清学检测试剂的研制需要进一步规范化和标准化,提供更加可靠的临床数据,以便推动血清学检测的发展。

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