葛根素对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响

在肝外科临床实践中,常需阻断入肝血流以完成复杂的手术,如行肝破裂修补术、肝部分切除术等,当血供恢复后,再灌注对肝细胞的损伤更加严重,即所谓的HIR[1]。最近的研究表明,中性粒细胞、细胞因子等在HIR中起到了重要作用[2]。本实验通过建立大鼠HIR模型,用葛根素注射液经大鼠尾静脉注入,来观察葛根素对大鼠HIR的防治效果,进而探讨葛根素对大鼠HIR的保护机制。

1　资料与方法

1.1　实验动物：清洁级健康雄性SD大鼠80只(由赤峰学院实验动物中心提供),体重200～250g,随机分为Sham、IR、IP、Pue组,再按再灌注1h、3h、6h、24h分成4个时相,每组各时相为5只。

1.2　主要试剂：葛根素注射液(2ml∶100mg)为广东燕塘生物化学药业有限公司生产,生产批号：0112111。生化试剂盒MDA、SOD购于南京建成生物工程研究所。免疫组化试剂盒TNF-α、IL-6购于北京中杉生物技术有限公司。

1.3　实验方法

1.3.1　动物模型制备：按Nauta等[3]法制作HIR模型,即入腹后显露第一肝门部,分离胆管及门静脉、肝动脉分支,用无创动脉夹夹闭肝左叶及中叶血流,造成70%肝脏缺血,但不影响门静脉血液回流,防止门静脉和胃肠道淤血,40min后移走动脉夹恢复血流。

1.3.2　标本取材和收集：各组分别在再灌注1h、3h、6h、24h对5只大鼠采血,3000r/min离心30min,提取血清,置-20℃冰箱待测;上述4个时间点每组各取1只大鼠的左肝固定部分组织,立即置于3%戊二醛中固定。

1.3.3　实验指标检测

1.3.3.1　肝脏生化指标：取血清1ml,利用全自动化生化分析仪,检测血清ALT水平。血清MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法、SOD采用黄嘌呤氧化酶法。

1.3.3.2　免疫组化染色及结果判定：按照TNF-α、IL-6免疫组化试剂盒SP法染色步骤操作。　　

TNF-α、IL-6的阳性表达为细胞核内呈现棕黄色颗粒。采用光学显微镜下分别计数阳性细胞率。

1.3.3.3透射电镜检查：取出固定的肝组织,修成数个2.5px3组织块,用磷酸盐缓冲液冲洗3次(每次10min),置于1%锇酸中固定,梯度酒精脱水,浸透,包埋,电镜观察。

1.3.4　统计学分析：利用SPSS13.0统计软件包对实验数据进行处理分析,结果以均数±标准差(x±s)表示,SNK法进行组间比较。

2　结果

2.1　肝脏酶学检测结果：IR、IP及Pue组肝缺血后再灌注各个时相的血清ALT、MDA水平均明显高于Sham组(P<0.01)。与IR组相比,IP和Pue组各个时间点的值(P<0.01)。与IP组相比,Pue组各个时间点的值(P<0.05)。另外,IR、IP及Pue组ALT、MDA在再灌注后6h升高到最高(P<0.05)。而SOD则在IR、IP和Pue组肝缺血后再灌注各个时相明显低于Sham组(P<0.01)。与IR组相比,IP和Pue组各个时相点的值(P<0.01)。与IP组相比,Pue组SOD各个时相点的值(P<0.05)。见表1、表2。

2.2　再灌注后TNF-α、IL-6的表达：表3为TNF-α及IL-6表达情况：与Sham组相比,IR、IP及Pue组在肝缺血后再灌注后各个时间点的表达均明显增加(P<0.01);与IR组相比,IP及Pue组的表达均明显减少(P<0.05);与IP组相比,Pue组的表达均明显减少(P<0.05)。

2.3　透射电镜下观察肝细胞结构变化：再灌注6h后,电镜下行肝细胞超微结构观察,见图1～4。　　

Sham组细胞核核膜结构清楚,无固缩,胞浆内内质网及线粒体形态正常,排列规则;IR组线粒体肿胀明显,伴扩张,嵴变形、断裂,部分细胞核核膜消失,内质网扩张,其上的核蛋白体脱落;IP组线粒体轻微肿胀,无明显扩张,核膜结构较清晰,内质网无明显扩张,排列较规则;Pue组仅有少量线粒体略肿胀,偶有轻微扩张,核膜结构清楚,内质网略轻度扩张,排列很规则。

3　讨论　　

HIR是多细胞参与的病理生理过程。先前研究认为HIR主要是氧自由基及脂质过氧化对肝脏造成损伤,近些年认为是一个全身炎症反应过程[4]。本研究中大鼠肝缺血再灌注对肝脏造成了严重损伤,以再灌注6h为著,表现为生化指标明显升高,以及炎症因子TNF-α、IL-6的阳性表达,同时肝细胞内的超微结构改变。通过本实验得出,Pue与IP组通过消除氧自由基、脂质过氧化,下调炎症因子共同作用对HIR肝脏的保护,且Pue组效果要更好(P<0.05),具体阐述如下。　　

HIR时,机体通过多种途径产生大量氧自由基,引发脂质过氧化反应,导致肝细胞损伤。而SOD及MDA是目前公认的反映机体氧自由基水平及脂质过氧化损伤程度的间接指标[5]。本实验显示：HIR期间,血浆SOD活性显著下降,而MDA水平明显升高;自由基启动脂质过氧化过程中生成的脂质过氧化物,使肝细胞膜结构改变,最终引起肝细胞的损伤、坏死、凋亡。　　

缺血再灌注损伤主要是中性粒细胞(PMN)介导的炎性反应,激活的PMN在细胞因子和化学介质的引导下,释放大量化学介质,造成肝组织损伤。TNF-α在这一过程中参与细胞的损伤,研究表明[6]：在HIR期间肝脏KC细胞分泌大量TNF,过量TNF诱导氧自由基的产生及脂质过氧化,导致肝脏损伤。本研究中,缺血再灌注后TNF-α在肝组织中的表达随再灌注时间延长而逐渐升高。与IR组相比,IP和Pue组低于IR(P<0.05);Pue组低于IP组(P<0.05)。IP作为一种公认的对HIR的保护作用已有文献报道[7]。IP后血液TNF-α水平的上升受到抑制,推断其对肝脏的保护效应可能与下调TNF-α水平有关,这也提示Pue的保护效应也可能是通过下调TNF-α水平对HIR起到很好的保护作用。IL-6主要来源于单核细胞、淋巴细胞产生的细胞因子,参与机体炎症、免疫调节等过程。而肝脏是合成和清除IL-6的重要场所。HIR时IL-6水平显著升高,有研究证实[8],IL-6可激活KC细胞分泌更多的细胞因子,还可显著地降低PMN的自然凋亡率,进而加重了炎症反应程度。实验表明,IR组较Pue及IP组IL-6明显升高(P<0.05),而Pue组较IP组更低(P<0.05),可以得出葛根素及IP都可减少IL-6的形成,而葛根素抗炎效果要比IP好。

葛根素具有抗自由基损伤、抑制血小板活化与聚集等药理作用,笔者认为,在肝缺血早期葛根素通过清除氧自由基及减轻脂质过氧化反应,尤其是通过下调TNF-α、IL-6水平来削弱PMN在HIR过程中产生的炎症反应,来改善肝细胞缺氧状态,同时降低了PMN激活率,从而减少了大量炎性因子的产生。

4　参考文献

[1]Serracino-Inglott F,Habib NA,Mathie RT.Hepatic ische-mia-reperfusion Injury[J].Am J Surg,2001,181(1)：106.

[2]Toledo-Peereyra LH,Suzuki S.Neutrophils,cytokines and adhesion molecules in hepatic ischemia and reperfusion injury[J].J Am Coll Surg,1994,179(6)：758.

[3]Nauta RJ,Tsimoyiannis E,Uribe M,et al.Oxygen-derived free radicals in hepatic ischemia reperfusion injury in the rat[J].Surg Gynecol Obstet,1996,171(2)：120.

[4]Weinbroum AA,Hochhauser E,Rudick V,et al.Multiple organ dysfunction after remote circulatory arrest：common pathway of radical oxygen species?[J].Traums,1999,47(4)：691.

[5]Sewerynek E,Reiter RJ,Melchiorri D,et al.Oxidativedam ageintheliverinducedbyischemia-reperfusion：protectionbymelatonin[J].Hepatogastroenterology,1996,43(10)：898.[6]　王万铁,林丽娜,谢克俭,等.肿瘤坏死因子在肝缺血/再灌注损伤中的作用及异丙酚的干预[J].中国急救医学,2003,23(11)：783.

[7]Kume M,Yarnamorao Y,SandS,el al.Ischemicpreconditi omngoftheliverinrats：implicationsofheatshockproteininduc tiontoincreasetoleranceofischemia-reperfusioninjury[J].JLabClinMed,1996,128(3)：251.

[8]张银中,叶铁虎,赵丽云,等.细胞因子白介素-6和白介素-10对中性粒细胞凋亡的影响[J].武警医学,2004,15(9)：647.