HER2在结直肠癌中的表达及意义

　　【摘要】 目的 研究HER2在结直肠癌的表达及意义。方法 应用pathway array analysis方法分析了56例结直肠癌肿瘤组织及癌旁正常组织中HER2的表达。结果 在56例结直肠癌患者中共发现HER2阳性表达35例，21例正常黏膜组织中HER2过表达，其中16例结直肠癌患者有淋巴结转移。结论 HER2的表达与结直肠癌的发生发展相关，检测HER2的表达可作为判断结直肠癌的生物学行为和预后的重要指标。

　　【关键词】 结直肠癌;HER2;pathway array

　　国内外研究表明，ErbB2及表皮生长因子受体与多种肿瘤相关〔1〕。已发现在人类肿瘤的改变包括基因扩增导致受体表达、激活激酶域突变主要集中在表皮生长因子受体，并且ErbB2在表皮生长因子受体的胞外域〔2～4〕在基因框架中缺失 ，每一种改变都可以导致受体的持续激活从而促进癌症的发展。针对HER2的单克隆抗体及小分子抑制剂(贺赛汀)已经在乳腺癌及非小细胞肺癌等的治疗中广泛应用，但是在结直肠的应用鲜有报道。本实验采用pathway array analysis方法研究HER2及其信号通路在结直肠癌组织及癌旁正常黏膜组织中的表达，探讨HER2表达变化与结直肠癌发生、病理类型及预后的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本来源

　　收集手术切除结直肠癌标本56例，其中高分化腺癌16例，中分化腺癌21例，低分化腺癌12例，黏液腺癌7例。同时取这些病例标本癌旁正常黏膜组织作为对照。所有标本在取材后20 min内迅速置于干冰上，而后再转入-70℃冰箱中进行低温保存。

　　1.1.2 抗体

　　106种抗体均购于Sigma及Cellsignal公司。pPKCα (Ser657)/pEGFR (Tyr1068)，pHER2/ErbB2 (Tyr1221/1222)/pPDK1 (Ser241)，pPKC α/βⅡ (Thr638/641)/pp53 (Ser392)，pAKT (Ser473)/pPTEN (Ser380)，pRB (Ser780)/pSurvivin，pbetacatenin(Ser33/37/Thr41)/pstat5(Tyr694)，pStat3 (Ser727)/pERK，Thr202/Tyr204)(P44/42)pcKit (Tyr719)/pEGFR (Tyr1148)，pp70 S6 Kinase (Thr389)/pVEGFR Receptor 2 (Tyr951)pFGFR (Tyr653/654)/peIF4B (Ser422)，pHGF R，cMET (Y1234/Y1235)/pSmad (Ser463/465)pERK5 (Thr218/Tyr220)/pp90RSK (Ser380)，pHGF R/cMET (Y1003)/pCREB (Ser133)，pmTor (Ser2448)/pPKCδ (Thr505)，pIKB (Ser32)/pIGF1 R / Insulin R (Tyr1131/Tyr1146)，pcdc2 (Tyr15)/pcJun (Ser73)，pRb (Ser807/811)/pSAPK/JNK (Thr183/Tyr185)，pFLT3(Tyr 591)/pp38 (Thr180/Tyr182)，Protein marker (Invitrogen)+IgG (25ng)cyclin B1/cyclin D1，Cdk6/cdc25B，cyclin E/cdk2，p27/BRCA1，Cdk4/Neu，1433 Beta/cPKCαERK/EGFR，Wee1/Cdc25C，Hsp90/CHK1，MDM2/cdc2 p34，E2F1/PCNA，cmyc/FGFR3 (B9)Notch 1/betacatenin，Akt/Trap，×IAP/Bcl2，ETS1/HIF1α，HIF2α/TTF1，p53/Notch4 (L5C5)PTEN/SRC1，p300/ckit，Ba×/Ncadherin，raf1/PCNA，cdc42/Eif4b，βactin/betatubulin/GAPDH， TNFα/Vimentin，OPN/Survivin，Ecadherin/TGFβ，p16/p27，WT1/Mesothelin，Cleaved Caspase3/CO×2，CREB/ATF1，p21/NFkB52，NFkB50/Calretinin，VEGFR2/p14，HRas/Bcl6，KRas/alphatubulin ，NFkBp65/Myf6。

　　1.2 方法

　　1.2.1 组织标本总蛋白提取、定量

　　(1)结直肠癌组织标本从液氮中取出后，迅速放置于锡箔纸包被的干冰上，使其保持低温状态防止蛋白的降解。利用取材管穿取约3 mm×3 mm×5 mm大小的组织块，加入1ml 蛋白裂解液于冰上用匀浆器研磨1 min，裂解10 min。(2)组织匀浆液转移至EP管。于超声水浴器中超声震荡3次，每次15 s。然后将样品置入4℃离心机(RCF：14 000 r/min)离心30 min;取上清即为提取总蛋白;(3)蛋白定量采用BCA法测定，样品放入37℃孵育30 min;(4)取出样品用分光光度仪在560 nm测定蛋白浓度，每个样品浓度取平均值。(5)然后将其浓度都稀释至2.5 μg/μl，加入1/3体积4×缓冲液，煮沸5min，置于-70℃冰箱保存。

　　1.2.2 pathway array analysis

　　(1)取出样品解冻后，煮沸10 min，吸取186.7 μl，加入已制备好的10% SDSPAGE胶顶层的合成胶，均匀横铺整个合成胶。(2)电泳：横压100 V，电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部。(3)转膜：卸下分离胶，将硝化纤维素膜(BioRad)、电转专用滤纸和海绵在电转缓冲液中浸泡平衡。电转时，从负极到正极依次是：海绵滤纸胶 硝化纤维素膜滤纸海绵，分别排除气泡，加入电转缓冲液，接通电源，恒压100 V 2 h。(4)封闭：电转结束后，取出硝化纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭40 min。(5)杂交：将膜置于免疫印迹杂交盒内 (Western blotting manifold BioRad)，共20条杂交道，每条杂交道可以加1～2种抗体; 5%脱脂奶粉/TBST(12.5 ml 5 mol氯化钠溶液，12.5 ml 1 mol Tris盐酸，pH7.5，1 ml 吐温20，用水加至1 000 ml)稀释相应(抗鼠或抗兔)的一抗，与硝化纤维素膜4℃孵育过夜。(6)TBS 洗涤3×3 min，TBST洗涤2×3 min;5%脱脂奶粉/TBST稀释相应的二抗，与硝化纤维素膜室温孵育1 h，从免疫印迹杂交盒中取下硝化纤维素膜，TBST洗涤3×8 min，TBS 洗涤3×8 min。(7) 增强化学发光(ECL，Pierce)显影混合液A和B适量1∶1混合，硝化纤维素膜浸没其中约3 min。(8)吸干显影剂。用塑料薄膜包住硝化纤维素膜，放入ChemiDoc XRS System仪器，根据发光情况曝光数秒～数分钟。

　　1.3 统计学方法

　　结果用quality one 4.5.0 (BioRad)定量并将数据转入Excel中进行统计分析，采用配对t检验。

　　2 结 果

　　2.1 HER2在大肠癌组织及正常黏膜组织中的表达

　　见表1。表1 HER2在大肠癌组织及正常黏膜组织中的表达(略)

　　HER2在组织中的阳性表达与肿瘤的分化程度无明显相关性，与是否淋巴结转移显著相关(P<0.01)。

　　2.2 HER2等蛋白在结直肠癌中表达情况

　　见图1及表2。图1为1号标本的结直肠癌组织和癌旁正常组织，所提取的组织总蛋白利用pathway array analysis，本例标本所杂交的抗体如下表2所示。其中箭头标记的蛋白分子为检测到的在肿瘤组织和正常组织内都有表达的蛋白分子。表2 抗体名称及所在条带(略)

　　2.3 HER2信号转导通路有关蛋白在肿瘤组织及周围正常黏膜组织中的表达

　　见图2。结直肠癌组织标本和癌旁正常组织标本经pathway array analysis后所得结果，以条形图形式给予呈现。共杂交了106种蛋白，包括磷酸化和非磷酸化的蛋白分子。其中检测到的有23种蛋白分子，22种存在有两倍以上的变化(本图筛选了与HER2/ErbB2信号通路相关的蛋白分子在癌组织与癌旁正常黏膜组织中表达情况的比较)，图2为其中8种差异有统计学意义蛋白的表达。

　　3 讨 论

　　ErbB家族包括EGFR、ErbB2,ErbB3和ErbB4,是具有典型的胞外受体结合位点的酪氨酸激酶受体，包括一个跨膜区和一个酪氨酸激酶细胞质域〔5，6〕。EGF家族与ErbB受体结合，基于不同的受体区分为3组：第一组包括EGF，肿瘤坏死因子TGFα、双向调节因子AR，EPG(与EGFR特异性结合);第二组包括BTC，HB(HBEGF)和EPR，双重特异性，可以结合EGFR和ErbB4;第3组，NRG，分为2个亚组，可以结合ErbB3和ErbB4或者单独结合ErbB4。与配体结合后激活特异性单聚体或二聚体的受体形成并且激活了胞质内激酶区域，使受体尾端区域磷酸化。受体的磷酸化引发了特异信号传导分子的结合，这些信号传导可以引起下游信号的改变〔7～9〕。

　　HER2/ErbB2信号传导通路对大肠癌细胞生长和生存有着重要的调节作用〔1，5，8〕,表皮生长因子受体(EGFR)是酪氨酸激酶跨膜受体，配体与受体结合后引起受体的二聚化作用，形成同型或异型二聚体〔10〕。二聚化的受体发生交联磷酸化，即一个受体和另外一个受体上特定酪氨酸残基磷酸化，激活胞内区的TK亚区，从而激发下一级信号传导。EGFR主要与HER2形成二聚体。EGFR活化可分为3个步骤：(1)EGFR与配体结合后可导致受体形成同源二聚体，也可与其他EGFR家族形成异源二聚体;(2)二聚体的形成促使EGFR胞内区6个特异的受体酪氨酸残基磷酸化，分别依次将外界各种信号转导至胞内。主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras→Raf→MAPK途径;另一条是PI3K→PKC→IKK途径;(3)当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化，使EGFR表达增加〔10〕。

　　在本研究中，通过对56例结直肠癌患者手术切除标本取材的癌组织标本及癌旁正常黏膜组织的pathway array analysis结果中，一些蛋白质在癌组织中过表达，如：pPKC α，pHER2，cyclin D1，P27，另外一些蛋白质在正常黏膜组织中过表达，如：pPKC α/βⅡ，ERK1/2,XIAP，betacatenin。通过对肿瘤转导通路的研究，发现ErbB2的激活导致下游MARK通路的活化，ERK1/2的过表达引起cyclin D1过表达。最终在细胞核内引起DNA活化，细胞增殖，并迁移和侵袭，从而可以引起肿瘤的增殖和转移。本研究中在正常黏膜组织中ERK1/2过表达，而cyclin D1在组织中过表达，这与经典的ErbB2转导通路并不完全一致，说明在MAPK途径当中，还有其他的肿瘤信号参与调控;在ErbB3激活PI3K信号转导通路途径当中，下游的P27在肿瘤组织过表达，P27的活化导致细胞的增殖，调控细胞周期引起肿瘤的迅速生长。

　　本组大肠癌患者的病理检查结果显示，在淋巴结转移的癌组织标本当中，HER2的表达阳性率达到93.75%,在大肠癌组的表达率为62.5%，在无淋巴结转移的病例中，HER2的表达率为20.83%，在有淋巴结转移组中HER2的表达明显高于无淋巴结转移组，从而说明HER2表达与结肠直癌的转移相关，但是与结直肠癌的分化程度无明显相关性，对于这一特性还需要进一步深入研究。

　　本研究提示，可以研究结直肠癌患者病理组织HER2的表达水平判断患者的预后;另外，通过抑制HER2的表达是否可以用来治疗HER2表达阳性的结直肠癌患者，尚待深入探讨。

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