ppGalNAcT2反义RNA对胃癌细胞SGC7901生物学特性的

【摘要】目的研究人胃癌细胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶2 (ppGalNAcT2) 基因表达与肿瘤转移相关基因MMP2，TGFβ1表达的相关性，以及对细胞增殖和形态生物学特性的影响。方法： 用两个已构建好的反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901，通过G418筛选，建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901 ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆。通过共聚焦显微镜，RTPCR检测反义封闭ppGalNAcT2基因RNA表达后，胃癌细胞SGC7901中TGFβ1，MMP2表达水平，细胞增殖以及形态的变化。结果： 反义封闭ppGalNAcT2基因表达后, 胃癌细胞SGC7901 ppGalNAcT2的表达水平明显降低，细胞的形态发生改变，分裂增殖减慢。结果还显示，反义封闭ppGalNAcT2基因表达可使TGFβ1，MMP2基因在mRNA表达水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响。 结论： ppGalNAcT2可能在肿瘤的增殖、浸润和转移中发挥作用。

【关键词】 SGC7901细胞; 多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶; 基质金属蛋白酶; 转化生长因子

Effects of ppGalNAcT2 antisense RNA on the biological behacior of human gastric cancer SGC7901 cell lineJIN Meifang1，2， SHAO Xuejun1, WU Shiliang2 (1.The Central Laboratory，the Children′ s Hospital of Soochow University;2.Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical college of Soochow University, Suzhou Jiangsu 215123，China)

[Abstract] Objective: To study the effect on the cell proliferation and the level of MMP2 and TGFβ1 in the SGC7901 cells caused by antisense blocking ppGalNAcT2 gene expressionMethods： The antisense expressing vectors of two different length ppGalNAcT2 gene segments were constructed and transfected into SGC7901 cells.A series of subcellular clones aiming at blocking of ppGalNAcT2 gene expression of SGC7901 cells were established by G418 selection.After antisense blocking, the cells were first tested with fluorescent microscopy.Then the expression of ppGalNAcT2，MMP2 and TGFβ1 gene cells growth were studied with RTPCR.The effects of ppGalNAcT2 antisense RNA on the proliferation of SGC7901 cells were tested by MTT. Results： The results showed that ppGalNAcT2 level in SGC7901 cells was obviously redudced and the cell proliferation was slower after antisense blocking.It indicated that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression had influence on SGC7901 cell proliferation.It was also revealed that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression could increase the mRNA and protein level of MMP2 and TGFβ1. Conclusion： The result suggests that ppGalNAcT2 has an important role in the cell proliferation, invasion and metastasis of cancer.

[Key words] SGC7901 cell; polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase; matrix metalloproteinase; transforming growth factorβ1

糖蛋白的糖链按照其连接方式的不同，分为两大类：一类称N连接型糖链，又称N聚糖，主要存在于血浆蛋白和细胞膜及胞质的糖蛋白中。另一类称O连接型糖链，又称O聚糖，主要见于分泌液中的糖蛋白，俗称黏蛋白[1]。肿瘤细胞含有富含O聚糖结构域的膜结合黏蛋白类糖蛋白，这些糖蛋白的基因表达具有细胞特异性并且在肿瘤细胞中常发生变异。有关糖基转移酶的研究，以往人们较多地关注参与N糖苷键连接有关的酶，近年来随着O糖基化相关酶新基因的发现和克隆，有关O糖基化产生的糖链结构和功能的研究受到广泛重视。多肽:N乙酰氨基半乳糖转移酶(polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase，ppGalNAcTs)是O糖链合成第一步的糖基转移酶，ppGalNAcT2是该家族中组织分布及底物谱较广的成员，很有可能是O糖链合成的限速酶，有着重要的生物学意义[2]。

为了深入研究ppGalNAcT2的生物学功能，我们成功地构建了ppGalNAcT2反义表达质粒载体，反义封闭ppGalNAcT2基因表达[3];我们也成功地构建了ppGalNAcT2的RNA干扰真核表达载体，转染SGC7901细胞得到稳定的ppGalNAcT2基因剔除细胞株[4]。为探讨ppGalNAcT2在肿瘤细胞生长增殖及浸润转移中的作用，本研究将ppGalNAcT2反义重组载体运用脂质体介导转染人胃癌细胞SGC7901，得到封闭胃癌细胞SGC7901细胞ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆，并对其生长繁殖及浸润转移相关基因基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和转移生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)的表达进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

人胃癌细胞株SGC7901为本室保存。反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2由本室构建保存。RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司， RTPCR试剂盒购于Promega公司，转染试剂盒G418选择性抗生素购于Roche公司。PCR引物为上海博亚公司合成。NBT/BCIP染色试剂盒为华美生物工程公司产品，antihTGFβ1、antihMMP2及βactin 单抗均为R&D公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 重组质粒转染SGC7901细胞 pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重组载体分别是将T2全长序列1 716 bp和T2序列中的一片段753 bp经酶切后反向连接入pEGFPC1载体中，分别形成反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。转染前将SGC7901细胞接种于24孔板，加入不同浓度的G418观察细胞的死亡情况，确定最低致死浓度。将处于对数生长期的SGC7901细胞接种于培养瓶(1×106/ml)，于37℃，5%CO2孵箱中孵育12 h后，按FUGENE6介导转染贴壁细胞的方法，将纯化的重组质粒和阴性空质粒转染SGC7901细胞。72 h后加入G418溶液至终浓度为600 mg/L，培养2周左右直到出现抗G418细胞克隆。

1.2.2 共聚焦显微镜观察 将盖玻片置于6孔板中，把转染过的细胞培养于其中，待细胞长到30%～40%的汇合度时弃去培养基，用PBS轻轻淋洗后，每孔加1 ml 4%低聚甲醛固定半小时后，吸出低聚甲醛，用PBS洗2遍，封片后置于共聚焦显微镜下观察转染进细胞的质粒所表达的GFP荧光。

1.2.3 细胞形态学观察 将未转染细胞、转染空载体的细胞及转染了反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2的细胞株分别命名为SGC7901，SGC79010，SGC7901FDT2，SGC7901FXT2，将4种细胞置于显微镜下，观察其形态的变化，并拍照记录。

1.2.4 相关基因的检测 细胞总RNA的提取采用Trizol一步法。以所得到的细胞总RNA为模板，使用Promega公司的试剂盒进行RT反应，得到cDNA。选用βactin为内对照，以各种细胞株的总RNA的RT产物为模板同时进行PCR扩增，检测转染反义ppGalNAcT2的SGC7901细胞ppGalNAcT2，TGFβ1，MMP2等相关基因表达的变化。PCR反应条件是94℃预变性4 min， 94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃再延伸10 min。PCR引物序列及预扩增片段长度如下(表1)。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，胰酶消化成单个细胞悬液后，计数细胞，将细胞调整到一定浓度后，接种于96孔板上，每孔加200 μl细胞悬液，每隔24 h随机取4孔，各加MTT 50 μl，5 h后小心吸去液体，加二甲基亚砜(DMSO) 150 μl，待显色后转移到酶标仪上测定光密度值(490 nm)。以第1天的光密度值为1以后各天显示值为与第1天之比值，作生长曲线图，观察细胞增殖变化。

2 结 果

2.1 共聚焦显微镜观察结果

在共聚焦显微镜下观察到转染后的细胞发出绿色荧光(图1)，并发现GFP绿色荧光都集中于胞质中，证实转染成功。表1 PCR引物序列

2.2 转基因细胞形态学观察结果

荧光显微镜下可以看到转染了反义RNA载体的细胞形态有所变化，相对于未转染的细胞及转染了空载体的细胞其形态更显得梭长，提示转染反义重组载体可能影响细胞的生长特性(图2)。

2.3 转移相关基因的变化

结果表明转染了pEGFPFDT2和pEGFPFXT2细胞ppGalNAcT2的mRNA表达明显降低，而TGFβ1和MMP2的mRNA表达水平均相对增加(图3)。显示ppGalNAcT2可能与肿瘤的浸润转移密切相关。

3 讨 论

ppGalNAcT及其家族作为黏蛋白O糖基化的起始酶，可能与肿瘤的生长和转移密切相关。我们观察了ppGalNAcT2在8种肿瘤细胞中的表达谱后发现[3，5]，在人胃癌细胞株SGC7901中，ppGalNAcT2的表达较其他细胞要高。本研究通过转染表达ppGalNAcT2反义RNA的质粒，成功获得了ppGalNAcT2表达受抑制的人胃癌细胞克隆，为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供了实验模型。进一步的相关功能研究结果表明，转染了ppGalNAcT2反义RNA的质粒的SGC7901细胞ppGalNAcT2 mRNA表达水平降低，TGFβ1，MMP2的mRNA表达水平均相对增加。由于TGFβ1，MMP2都与肿瘤的浸润转移及增殖相关，因此推测ppGalNAcT2与肿瘤的浸润转移及增殖密切关联。

关于转移瘤生长相关的细胞因子，近年来研究较多的有IGFⅡ，TGFβ，EGF，IL6等。TGFβ1基因被认为参与了信号转导、细胞生长、转化和肿瘤发生等过程，在许多肿瘤组织中高表达。TGFβ1可促进某些肿瘤细胞的局部浸润或腹膜播散，并削弱免疫系统对肿瘤的排斥效应[6]。TGFβ mRNA表达受多种因素的影响，近年的研究发现TGFβ mRNA的水平升高似乎与高糖的程度呈正相关[7]，Ziyadeh等在体外研究中证实，高糖增强系膜细胞TGFβ mRNA的表达及活性，而在糖尿病研究中也发现非酶糖基化产物可促进TGFβ1 mRNA的表达。本研究中转染了表达ppGalNAcT2反义RNA的质粒的SGC7901细胞TGFβ1的表达明显高于未转染的细胞和转染空载的细胞。可能的原因是由于抑制了细胞内ppGalNAcT2的表达，酶促糖基化减少，而非酶糖基化增加，这样同时增加了糖浓度和非酶糖基化产物。这两个因素可促进TGFβ1 mRNA表达相对增加。而TGFβ1又与MMP的表达密切相关，TGFβ1能诱导人类细胞株转录出高水平的MMPs mRNA[8]。有报道称，在转基因小鼠的研究中发现TGFβ的过表达能抑制良性皮肤瘤的形成，而对于皮肤癌却能促进其浸润转移，并证实是MMPs合成增加所致[9]。在本研究中，ppGalNAcT2反义RNA能抑制ppGalNAcT2的表达,而ppGalNAcT2表达水平的降低促进了TGFβ1的表达，进而可能促进MMPs的合成。

TGFβ1是具有双重调节作用的因子，体外实验证明TGFβ1是肿瘤细胞生长的主要负性调控因子，TGFβ1与细胞表面受体结合，通过p53和PRB的低能磷酸化，抑制cmyc的表达，使细胞分裂停止，抑制肿瘤细胞的生长[10,11]。在本研究中，推测ppGalNAcT2的减少导致TGFβ1的合成增加进而减慢了细胞的生长。

我们的工作还观察到ppGalNAcT2对胃癌细胞SGC7901对细胞外基质成分的黏附能力有影响[12]，因而有关ppGalNAcT2在整体动物肿瘤生长、浸润与转移过程中的作用值得进一步研究。

【参考文献】

[1] Dwek RA.Glycobiology:toward understanding the function of sugars[J].Chem Rev，1996,96(2):683-720.

[2] Iwasaki H, Zhang Y，Tachibana K，et al.Initiation of oglycan synthesis in IgA1 hinge region is determined by a single enzyme, UDPNacetylαDgalactosamine:polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase 2[J].J Biol Chem, 2003, 278(8): 5613-5621.

[3] 金美芳，刘可人，周嘉梁，等.人多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2基因反义RNA表达质粒的构建及克隆鉴定[J].江苏大学学报：医学版，2005，15(2)：100-103.

[4] 仇 灏，刘可人，朱俐燕，等.人多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)RNA干扰载体的构建及鉴定[J].江苏大学学报：医学版，2007，17(2)：102-104.

[5] 仇 灏，陈克平，周嘉梁，等.Northern杂交检测多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2在不同肿瘤细胞中的表达水平[J].江苏大学学报：医学版，2005，15(1)：14-16.

[6] Massague J.The TGFβ family of growth and differentiation factors[J].Cell, 1987, 49(4): 437-438.

[7] Iwano M, Kubo A, Nishino T, et al.Quantification of glomerular TGF beta1 mRNA in patients with diabetes mellitus[J].Kidney Int, 1996， 49(4): 1120-1126.

[8] StetlerStevenson WG.Type IV collagenases in tumor invasion and metastasis[J].Cancer Metastasis Rev, 1990, 9(4): 289-303.

[9] Cui W, Fowlis DJ, Bryson S, et al.TGF beta1 inhibits the formation of benign skin tumors, but enhances progression to invasive spindle carcinomas in transgenic mice[J].Cell, 1996, 86(4): 531-542.

[10] Glick AB.TGF beta1, back to the future: revisiting its role as a transforming growth factor[J].Cancer Biol Ther, 2004, 3 (3): 276-283.

[11] SanchezCapelo A.Dual role for TGFbeta1 in apoptosis[J].Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16 (1): 15-34.

[12] 岳爱环，行书丽，唐春花，等.N乙酰氨基半乳糖转移酶2对胃癌细胞SGC7901黏附迁移能力的影响[J].江苏大学学报：医学版，2008，18(3)：223-226.