人乳腺癌中淋巴管密度与淋巴管生成的研究
发表时间：2012-08-27 浏览次数：763次
作者：李伟,姜长滨,侯延君,宋传健,张正旭 作者单位：150076 武警黑龙江省总队医院普外科
【摘要】 目的 研究人乳腺癌组织中淋巴管密度及淋巴管生成的情况。方法 随机选取60例乳腺良性病变标本和123例乳腺癌标本，进行免疫组化染色，用Podoplanin抗体标记淋巴管，在光镜下计数各标本中的淋巴管密度。结果 乳腺癌组织中Podoplanin染色阳性的淋巴管具有壁薄、管腔形状不规则、细胞核突向腔内等特点，与良性病变相比，乳腺癌组织中淋巴管密度增加，其差异有统计学意义(P<0.05)。结论 乳腺癌组织中淋巴管密度增高，这提示乳腺癌中存在淋巴管生成。
【关键词】 乳腺癌 淋巴管密度 淋巴管生成
近年来，对肿瘤的淋巴管生成(lymphangiogenesis)研究逐渐兴起。在本研究中，作者用淋巴管内皮特异性标志物Podoplanin标志淋巴管，用免疫组化染色的方法，观察、研究原发人类乳腺癌组织中淋巴管密度的变化，进而探讨乳腺癌中淋巴管生成的情况。
1 材料与方法
1.1 标本来源 所有组织标本随机取自2003年2月至2007年12月本院普外科行手术治疗的乳腺疾病患者，其中乳腺癌123例，良性乳腺疾病60例。全部病例术前均未接受化疗、放疗及其它治疗。乳腺癌患者年龄32～68岁。
1.2 主要试剂 兔抗人Podoplanin单克隆抗体，购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人FⅧ-RA多克隆抗体和PV-9000二步法免疫组化试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。
1.3 实验方法 123例乳腺癌及60例良性病变组织蜡块均行4μm连续切片，分别做HE和免疫组化染色。免疫组化染色步骤按PV-9000二步法试剂盒说明进行。FⅧ-RA染色用酶消化法修复抗原，Podoplanin染色用高压法修复抗原。一抗的工作浓度：FⅧ-RA为1∶200，Podoplanin为1∶500。在光镜下监控显色，中性树脂封片。以已知的阳性对照片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.4 结果判定 (1)免疫组化：染色时内皮细胞出现棕黄色着色为阳性，其中以FⅧ-RA为血管内皮标志物，以Podoplanin为淋巴管内皮标志物，并在光镜下观察着色淋巴管的形态学特征。(2)计数方法：参照Weidner[1]的校正技术，先在光镜低倍视野(40×)下观察，寻找“热点”，选取着色细胞密集的热点，在高倍视野(200×)下观察，鉴别着色的淋巴管并计数。以3～5个200倍视野内淋巴管数的平均值作为该切片的淋巴管密度。
1.5 数据处理 实验数据用(x±s)表示，进行癌组织与良性病变之间两样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本研究的结果显示：(1)FⅧ-RA呈阳性的血管对Podoplanin抗体无反应;(2)乳腺癌组织中Podoplanin染色阳性的淋巴管具有壁薄、管腔形状不规则、细胞核突向腔内等特点，管壁周围缺乏周细胞;(3)乳腺癌组织中Podoplanin阳性的淋巴管主要分布在癌细胞团的边缘和肿瘤的间质中，在癌细胞团的中央区则缺乏染色阳性的淋巴管;(4)123例乳腺癌标本的淋巴管密度为5.2256±1.1649(单位：个/200×视野，下同)，60例乳腺良性病变的淋巴管密度为1.2363±0.1869。乳腺癌标本中淋巴管密度增加，与良性病变比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
目前，我国乳腺癌的发病率逐年增高，研究乳腺癌的淋巴道转移具有很高的现实意义。随着对肿瘤淋巴管生成研究的进展，对于乳腺癌淋巴管密度和淋巴管生成的研究也受到人们的重视。
在本实验中，作者用Podoplanin作为淋巴管的标记，这是一种特异性的淋巴管内皮标志物[2]。在本实验中作者发现，Podoplanin特异性地表达于淋巴管内皮，但不表达于血管内皮;表达Podoplanin的淋巴管具有薄壁、管腔不规则、内皮细胞核突向腔内等微观特点，而FⅧ-RA呈阳性的血管对Podoplanin抗体无反应。说明Podoplanin作为淋巴管内皮标志物具有较好的特异性，这与Breiteneder-Geleff等[2]的研究结论相一致。
在本实验中，通过计数淋巴管密度可以发现，相对于良性病变，在乳腺癌组织中存在淋巴管密度的增加，这种变化主要在癌细胞团的边缘和间质中较为明显，在癌细胞团的中央区未见到染色阳性的淋巴管。造成这种情况的可能原因是，癌细胞增生活跃使中央区组织压力过高，压迫其中的淋巴管使其萎陷，而肿瘤细胞及部分间质所产生的大量VEGF-C、VEGF-D等生长因子，又刺激淋巴管在组织相对疏松的边缘区和间质中增生、扩张，引流组织液，从而调节过高的组织间压力。
本实验结果显示，在乳腺癌组织中存在淋巴管密度的增加，在乳腺癌组织中Podoplanin显示的淋巴管密度平均值高于乳腺良性病变组织，差异有显著性(P<0.05)。上述结果表明淋巴管生成真实存在于原发性乳腺癌组织瘤周及肿瘤边缘区，而且乳腺癌的淋巴管生成高于乳腺良性病变，这将在临床上对乳腺的良、恶性肿瘤的诊断提供有价值的参考。
由于淋巴管的通透性强，更有利于肿瘤细胞的转移、播散，因此研究乳腺癌的淋巴管生成对于控制乳腺癌的转移具有重要的意义。作者推断高密度的淋巴管可能促使肿瘤细胞与扩增的淋巴管接触并侵入淋巴管导致淋巴结转移。然而,原发肿瘤引起淋巴道转移的机制仍然是争论的焦点。争论主要有以下3种机制：肿瘤侵袭瘤内淋巴管，肿瘤侵袭瘤周已存在的淋巴管，肿瘤细胞诱导新淋巴管生长[3，4]。目前关键是弄清肿瘤的淋巴道转移过程中，是已经存在肿瘤周围的淋巴管起作用，还是肿瘤组织中新生的淋巴管起作用。进一步研究肿瘤淋巴管生成的分子机制，将有利于这些问题的解决，如果新生淋巴管对肿瘤转移是必需的，针对肿瘤淋巴管生成进行肿瘤治疗，从而抑制肿瘤的生长及转移将是一项有前景的治疗措施。
【参考文献】
1 张平.肿瘤血管生成评估.肿瘤防治研究，2001,28(1)：70～72.
2 Breiteneder-Geleff S, Soleiman A, Kowaslki H. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: Podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol,1999,152(2):385～394.
3 Pepper MS, Skobe M. Lymphatic endothelium: morphological, molecular and functional properties. J Cell Biol,2003,163:209.
4 Stacker SA, Achen MG, Jussila L, et al. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Nat Rev Cancer, 2002,2:573.
