祁连圆柏对人胃癌细胞增殖抑制作用的影响

　　作者：王索安,陈增良,徐涛,杜蓬　陶锋,王玮　　作者单位：310013 浙江高等医学专科学校　310013 浙江理工大学生命科学院

　　【摘要】目的 研究祁连圆柏体外对人胃癌SGC-7901细胞增殖和抑制的生物学效应。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)显色法，检测不同浓度祁连圆柏醇提物作用不同时间后对SGC-7901细胞生长的影响，倒置显微镜下观察细胞形态学改变，流式细胞术检测细胞凋亡百分率，免疫组化法检测SGC-7901细胞Ki-67与P53表达。结果 祁连圆柏能抑制SGC-7901 细胞生长,诱导细胞凋亡，并具有明显量效关系。结论 祁连圆柏具有抑制SGC-7901细胞增殖并可通过诱导该细胞系凋亡发挥抗肿瘤作用。

　　【关键词】 祁连圆柏;胃癌;细胞凋亡;流式细胞仪;细胞增殖

　　Effects of Juniperus przewalskii on the Proliferation and Inhibition of Human Gastric Carcinoma SGC-7901 Cells in vitro　　Wang Suoan，Cheng Zengliang， Xu Tao,et al　　Zhejiang College of Medicine,Hangzhou 310013,China

　　【Abstract】 Objective To study the biological effects of Juniperus przewalskii on human gastric carcinoma SGC-7901 cells in vitro. Methods By means of MTT reduction assay ,the effect of Juniperus przewalskii on the proliferation of SGC-7901 Cells was measured.Morphological changes were observed under the Inverted microscopy Apoptosis index was detected by Flow Cytometry (FCM) The expression of P53 and Ki-67 were determined by immunohistochemical procedeures. Results Juniperus przewalskii could significantly inhibit the proliferation and aggressivity of SGC-7901 cells and the inhibitory effect was dose-and-time-dependent. The action was mainly attribute to cell apoptosis as proved by flow cytometry assay and microscopy. Conclusion Juniperus przewalskii could significantly inhibit the proliferation and aggressivity of SGC-7901 cells. Aductive apoptosis is the main mechanism of this killing effect.

　　【Key words】 Juniperus przewalskii; Gastric Carcinoma; Apoptosis; FCM; proliferation.

　　祁连圆柏【Juniperus przewalskii】系柏科植物是常用藏药，青海:大部分林区均有分布,海拔为2600米(如大通河林区)。常绿针叶乔木，喜阳、耐寒、耐旱、耐瘠薄，多生长于阳坡和半阳坡。其资源丰富,量大易得，生长范围广，易于种植,成活率高是其优点。祁连圆柏已作为绿化观赏植物，在全国许多省市都有引种。该药具有止血镇咳之功效，临床上主要用于治疗咳血、吐血、尿血、便血及子宫出血等病症[1], 2000年宗玉英等对110种植物藏药进行了体外筛选实验,发现5种藏药对人的乳腺癌,肺癌,口腔上皮癌,具有杀伤作用,但抗肿瘤机制不明，祁连圆柏是其五种之一[2]。我们在抗肿瘤药物筛选时发现该药对人胃癌SGC-7901细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养

　　1.1.1 材料 胞株: 人胃癌SGC-7901细胞株购自上海细胞生物所。培养液：RPMI-1640 [sigma公司产品，用前加双抗、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)]。小牛血清：杭州四季青生物工程公司产品，56(C水浴，-20(C保存。0.25%胰酶、0.02%EDTA、Hanks液、3.7%NaHCO3等试剂自配。CO2培养箱(NATURE，USA)， 倒置相差显微镜：(Olympus CKX,Japan)。此次实验所选药物“祁连圆柏”源于青海大学医学院藏医系惠赠。

　　1.1.2 方法 ①细胞复苏：将冻存在离心管内的SGC-7901细胞用37℃水浴解冻。吸出细胞悬液,装入另一支离心管中,加入含15%小牛血清的1640培养液(PH7.2)，吹打混匀后离心(1000转/分，5min)，吸去冻存液。②细胞培养：复苏细胞加入含15%小牛血清的1640培养液充分混匀，使其浓度为5×104个/mL，接种于培养瓶中。置孵箱内(37℃，0.5% CO2)培养。③细胞转代：倒置显微镜下观察培养瓶内细胞长满单层后弃掉培养液。加入适量0.25%胰酶液(覆盖瓶底)，置37℃环境中消化1～2min。倒置显微镜下观察到细胞收缩并出现裂隙后终止胰酶反应。加入适量的Hanks液轻轻洗一遍后加入含15%小牛血清的1640液5mL吹打制成细胞悬液，按5×104个/mL浓度接种培养。

　　1.2 细胞增殖抑制试验(MTT还原法)

　　1.2.1 材料 药物提取主采用水提醇沉提取液法：取祁连圆柏200克,以石油醚(30～60℃)浸提至无色，药渣再以50%的乙醇提至无色，90%乙醇回收溶剂，在0.085～0.095mpa，60℃沸腾的条件下减压蒸馏，获得浸膏，浸膏真空低温冷冻干燥，制成褐色粉末样品。样品先以少量的二甲亚砜DMSO溶解，再用双蒸水稀释配置成为20mg/ml的原液，用0.22umol孔径的滤膜过滤除菌后-20℃避光保存，临用前用RPMI1640培养液稀释配成所需的药物浓度。噻唑蓝(MTT) sigma公司产品，用无血清1640培养液配制(浓度5mg/mL)，4℃避光保存。96孔培养板。自动酶标检测仪：DG3022A型。二甲基亚砜(DMSO)：国产分析纯。0.4%胎盼蓝溶液：自配。

　　1.2.2 方法 将对数期生长细胞用0.25%胰酶消化，使贴壁细胞脱离，用含15%小牛血清的1640培养液配成悬液。用胎盼蓝排除法测定细胞存活率：>97%。用含15%小牛血清的1640液调整细胞悬液浓度为1.0×105个/ mL。接种细胞于96孔培养板中，每孔100μL，5%CO2温箱中培养，24h后换液。实验组细胞加100μL终浓度达1.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的完全培养基，阴性对照组细胞加100μL完全培养基，空白对照孔仅含100μL完全培养基，不含细胞，每浓度时间组设6个复孔。分别继续培养24、48、72h。每孔加入5mg/mL MTT溶液25μL，37℃温育4h，使MTT还原为甲月赞。吸出上清液加入150μL DMSO(二甲基亚砜)使甲月赞溶解，轻微振荡摇匀。在上述条件下，用自动酶标仪在波长570nm处测定每个小孔的光度值(OD值)。杀伤率计算公式：杀伤率=(1-试验组OD值)×100%/对照组OD值。

　　1.3 光镜下细胞形态的观察

　　1.3.1 培养瓶中细胞形态观察 培养瓶中接种1×106个细胞，培养24h，生长良好者，用不同浓度(1.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)祁连园柏分别处理24、48、72h，每12h用倒置显微镜观察并照相记录用药组和对照组细胞的形态变化。

　　1.3.2 细胞爬片HE染色下细胞形态的观察 用6孔培养板接种1×106个细胞，培养24h，观察生长良好，不同浓度不同时间各组分做6个复孔，其余处理同1.3.1。

　　1.4 流式细胞术检测

　　1.4.1 材料 碘化丙啶(PI)：Sigma公司产品。流式细胞仪：FACSVantage，美国B.D公司。

　　1.4.2 方法 收集实验组和对照组细胞各约1×106个，用PBS洗涤后离心3次。用70%冰乙醇在-20(C冰箱固定24h，离心去乙醇，PBS洗涤(5min×2次)、离心(1000转/分)3min，弃上清液。加入Rnase A(50μg/mL)37℃温育30min后，加10μLPI(50ug/mL)置4℃暗处作用20min。用流式细胞仪检测细胞亚二倍体峰。

　　1.5 免疫组织化学染色

　　1.5.1 材料 P53及Ki-67过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

　　1.5.2 方法 ①细胞蜡块制作：参照文献[3]，略改进。收集对照组及分别用10μg/ml、20μg/ml祁连园柏24、48、72h组细胞，各组约1×107个，D-Hanks液洗涤(5min×2次)，低速离心后加入少许蛋清甘油(1：1)，以95%乙醇固定30min，离心弃掉乙醇，细胞块用拭镜纸包裹，常规酒精脱水后行石蜡包埋。②SP法免疫组化染色：常规切片脱蜡至水。3%过氧化氢孵育10min(以清除内源性过氧化物酶的活性)，PBS洗涤(5min×2次)。微波处理修复抗原，Ki-67微波修复30min，PCNA微波修复10min。5%正常羊血清室温孵育15min(以减少特异性吸附)。每张切片滴加50μL第一抗体，40℃过夜后，PBS洗涤4min×4次。每张切片滴加50μL生物素标记二抗，37℃孵育35min，PBS洗涤(4min×4次)。每张切片滴加50μL辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育1h，PBS洗涤(4min×4次)。DAB显色，自来水充分冲洗，复染，封片。③ 阳性指数计算：免疫组化结果用NYD-1000型图像分析仪处理，随机选取10个高倍视野的肿瘤细胞共1000个，计算每100个细胞中的阳性细胞数，亦即阳性表达指数(Positive Index PI)。

　　1.6 统计分析 采用方差分析，两组比较采用Dunnett-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT法检测结果 MTT法检测结果表明，祁连园柏在体外可明显抑制人胃癌细胞株(SGC-7901)细胞的增殖，以10μg/ml以上浓度作用更为明显，且呈现明显的剂量依赖性和作用时间的特点(表1)。

　　表1 祁连圆柏对胃癌细胞株(SGC-7901细胞的增殖影响(略)

　　注: 与处理组1.0μg/ml比较; **P<0.01; 各浓度时间组设6复孔。

　　2.2 倒置显微镜下观察细胞的形态学变化 对照组SGC-7901细胞4-6H贴壁,24H增殖旺盛,48H细胞呈高棱拄形、排列呈串珠样生长72H细胞长成致密单层。

　　实验组SGC-7901细胞经加药诱导12H后见有少数细胞邹缩、变圆变小、胞质内出现颗粒、细胞膜完整;24H后此类细胞进一步增多、部分细胞呈圆形、细胞核与胞质分辨不清、细胞间隙增大、细胞数目减少;48H后可见细胞呈集落生长特性明显降低、细胞多呈单个生长状态、细胞数目已显著减少、少量细胞脱落而悬浮于培养液中、大部分细胞裂解成圆形小体、另有部分细胞体积增大、呈圆形或椭圆形细胞内见颗粒出现。

　　实验组在24，48，72H后做细胞爬片HE染色，可见一些细胞邹缩、核染色质浓缩深染、并向核膜聚集、核碎裂、胞浆呈伊红着色的典型的调亡细胞形态(图1)，少量细胞呈溶解坏死状态。

　　2.3 流式细胞仪(FCM)检测结果

　　2.3.1 FCM检测结果见表2 人SGC-7901细胞经该药诱导后在FCM检测的含量图中，在G1期细胞前出现亚二倍体峰，既凋亡峰(图 3)，表明细胞DNA降解,渗漏导致DNA染色能力下降。凋亡峰随祁连园柏剂量加大作用时间的延长而增高。

　　表2 祁连园柏作用不同时间对人SGC-7901细胞的凋亡诱导率(略)

　　注: 与对照组比较，*P<0.01

　　2.4 免疫组织化学检测结果 免疫组化检测,Ki-67标记结果见表3，Ki-67阳性信号位于核内，均呈棕黄色。经祁连圆柏处理组表达明显降低(图3 )。P53诱导前后在对照组与实验组中均无表达。

　　表3 Ki-67免疫组化检测结果(略)

　　图1 实验组 细胞爬片(HE ×400)48h 经祁连圆柏处理见典型凋亡细胞(略)

　　图2 实验组FCM分析结果(经祁连圆柏20μg/ml 24H处理)(略)

　　图3 (免疫组化×100)Ki-67部分表达(经祁连圆柏10μg/ml 24H处理)(略)

　　3 讨论

　　天然药物的研究和开发历来是人类寻找和发现新药的重要途径之一，抗肿瘤药物也不例外。众所周知，从化学合成途径寻找抗癌新药的难度和成本，远远高于过从植物中发现抗癌新药。据文献报告，1989～1995年国际上299种抗肿瘤药物，从植物中提取的天然抗肿瘤成分及其衍生物所占比例高达61%[4]。化学抗癌药物普遍存在如下问题：①毒副作用严重;②;易诱导肿瘤的多药耐药性(MDR)。中、藏药或中西医结合能不仅能有效治疗恶性肿瘤，同时也能减轻放疗和化疗的毒副作用，早已肯定，肿瘤细胞可对抗肿瘤药物产生耐药性，是临床化疗失败主要原因。其中危害最大、最为常见的是多药耐药性(multidrug-resistance, MDR)所谓抗肿瘤药物的MDR，是指肿瘤细胞对其所接触的一种抗肿瘤药物产生耐药性后，对其它结构和作用机制不同的抗肿瘤药物也同时产生耐药性。值得关注的是，祁连圆柏对长春花碱具耐药性的KB-V细胞有良好的体外杀伤作用[2]。

　　本实验采用MTT法检测祁连园柏醇提物对人SGC-7901细胞的体外增值有明显的抑制作用，结果表明，祁连园柏醇提物对人SGC-7901细胞的增值抑制作用不仅呈剂量-效应关系，而且呈时间-效应关系，即具有明显的浓度和时间的依赖性。该药的此种作用特点与我国的传统抗肿瘤中药白英水提物报道类同[7]。

　　流式细胞仪分析表明经祁连园柏诱导后人SGC-7901细胞在PI荧光直方图中，凋亡细胞在G1/G0，前出现亚二倍体峰,即凋亡峰。这是因为凋亡细胞DNA降解渗漏致使细胞内DNA含量降低，结合PI减少，荧光强度减弱所致[8]。随着祁连圆柏浓度的增加，肿瘤细胞的凋亡率也增加。结合细胞爬片{HE}染色能观察到凋亡特征性改变：可见一些细胞邹缩、核染色质浓缩深染、并向核膜聚集、核碎裂、胞浆呈伊红着色的典型的调亡细胞形态提示该药确能诱导人SGC-7901细胞发生凋亡。

　　肿瘤细胞的增殖活性与肿瘤的浸润、转移和预后密切相关[5].KI-67仅在增殖态细胞中表达[6]，细胞中PCNA与KI-67表达增强反映肿瘤细胞具有较高增殖活性和较强的浸润和转移的潜能。祁连园柏在诱导人SGC-7901细胞凋亡的同时、KI-67表达明显降低、该效应呈现剂量和时间依赖性、结果表明祁连园柏能抑制人SGC-7901细胞增殖及侵袭性，并可通过诱导该细胞系凋亡杀伤癌细胞。值得思考的是祁连园柏诱导人SGC-7901细凋亡，其分子机理是什么?该药是否还存在其它杀伤癌细胞的途径?均需在以后的研究中进一步阐明。

　　【参考文献】

　　[1] 中药大词典.江苏新医学院.【上册】【M】上海科技出版社，1977:1852

　　[2] 宗玉英，党合群，骆桂法.110种植物藏药进行体外筛选的实验研究.[J]药学实践杂志，2000，18(5): 290-291

　　[3] 高洁，候敏，刘彤华.培养细胞的石蜡包埋切片用于免疫组织化学染色的优越性.中华病理学杂志， 1999，Vol 28 No 6 459-460

　　[4] Cragg GM, Newman DJ, Snader KM. Natural products in drug discovery and development. J Nat Prod, 1997, 60(1):52-60

　　[5] Wang JZ, Li XA, D, Souza WD,at al.Impact of prolonged fraction delivery times on tumor control:: A note of caution for intensity-modulated radiation therapy [IMRT] [J].Int J Radiat Oncol Biol Phyz,2003,57[2]::543

　　[6] Warbrick E, Heatherington W,lane DP,et al.PCNA brinding proteins in Drosophila melanogaster:the analysis of a conserved PCNA binding domain[J].Nucleic Acids Res, 1998,26(17):3925-3932

　　[7] Zhao LW, Wan FS. Apoptosis-induced effect of solanum lyratum thunb extract on human cervical cancer hela cells. Chin J Clin Pharmacol Ther 2007 Aug;12(8)883-887

　　[8] Wang SA, Song Q, Zhang XW, at al Study on apoptosis of human colorectal carcinomal cell line lovo inducted by 5-Flucorouracil and its molecular mechanisms. Chin J Clin Pharmacol Ther 2007 Aug;12(8)877-882