谷胱甘肽和缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响

　　作者：张厚忠 韩喜春 姜伟栋 作者单位：吉林大学第二医院基本外科，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 探讨肝脏缺血预处理(IPC)和还原型谷胱甘肽(rGSH，阿拓莫兰Atomolan)预处理的作用机理，通过观察二者单独或联合应用时对肝脏缺血再灌注(I/R)损伤的影响，以便能够找到一种防治肝脏I/R损伤更好的预处理方式。方法 50只健康的Wistar大鼠，在肝脏I/R前，按加和不加Atomolan;IPC前，按加和不加Atomolan及空白对照随机分成5组，作配对试验，分别检测血清谷丙转氨酶(ALT)、血清丙二醛(MDA)的数值及热休克蛋白(HSP)70免疫组化染色的结果。结果 rGSH预处理和IPC单独应用时均对肝脏I/R损伤有保护作用，并且rGSH预处理的效果好于IPC，但二者联合应用时，将相互拮抗。结论 rGSH预处理通过抑制氧自由基(OFR)爆发和中性粒细胞炎症，起到保护肝脏I/R损伤的作用，但同时也抑制了IPC产生HSP70的能力。

　　【关键词】 谷胱甘肽,缺血再灌注,缺血预处理;丙二醛;热休克蛋白70

　　外源性还原型谷胱甘肽(rGSH)和肝脏缺血预处理(IPC)都能预防肝脏I/R损伤，但是到底哪种方法的效果更好，二者同时应用又能引起何种结果，均未见报道。本实验将rGSH和IPC两种干预因素对大鼠交叉配对使用，检测血清谷丙转氨酶(ALT)、肝组织中热休克蛋白(HSP70)和反映氧自由基(OFR)含量的MDA，对比哪种方法既能对肝脏起保护作用,又能最大限度的减少肝组织的损伤，对临床防治肝外伤、手术及肝移植等所致的肝功能损伤提供参考。

　　1 材料与方法

　　11 材料 健康Wistar大鼠，雌雄不限，体重250～300 g，购自吉林大学白求恩医学部动物实验中心。ALT用本院检验科HITACHI7071A型全自动生化分析仪检测，MDA用比色法测定，试剂盒购自南京建成生物制品公司。热休克蛋白70(HSP70)免疫组化染色系统SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,编号SA2077;阿拓莫兰(Atomolan，还原型谷胱甘肽rGSH)购自重庆药友制药有限责任公司，规格：06 g，国药准字H19991067。

　　12 实验分组 50只大鼠，在肝脏I/R前，按加和不加Atomolan;IPC前，按加和不加Atomolan及空白对照随机分成5组，作配对试验，每组10只(n=10)。具体为：A组 (I/R): 尾静脉注射生理盐水(05～10 ml/100g )，然后肝门阻断90 min，持续再灌注24 h;B组( Atomolan+I/R),在持续肝门阻断前10 min尾静脉注射Atomolan (50 mg/kg)，然后肝门阻断90 min，持续再灌注24 h;C组(IPC): IPC前10 min尾静脉注射生理盐水，然后缺血5 min再灌注5 min，共重复2次后阻断肝门，缺血90 min，持续再灌注24 h;D组 (Atomolan+ IPC),IPC前10 min尾静脉注射Atomolan，其余操作同IPC组;E组(对照)：尾静脉注射生理盐水后，未给予任何处置，24 h后取肝组织及下腔静脉血。所有动物术前12 h禁食,自由饮水。

　　13 动物模型制备 氯胺酮腹腔内麻醉，配制方法(当天配制)：2 ml(100 mg)氯胺酮+4 ml 09%生理盐水，每只大鼠腹腔内平均注入2 ml，以后每次追加05 ml，麻醉效果可持续1～2 h。做标记并分别在左前、左后、右前、右后腿及背部编号A110，B110，C110，D110，E110，固定，正中剖腹，分离肝十二指肠韧带，暴露肝门部。所有缺血方法均为血管夹阻断门静脉进入肝脏第一次分叉以远，即阻断肝尾状叶及肝左叶血流，造成70%肝脏缺血，阻断达到所需的时间后，松开血管夹，进行再灌注。标本采集：再灌注后24 h取下腔静脉血及缺血部位的肝脏组织标本，取标本后处死大鼠。

　　14 指标的检测 于下腔静脉内取2 ml血液标本，分别注入两个试管各1 ml，静止沉淀析出血清，常温下离心5 min，(BFX5320型低速自动平衡离心机)4 800 r/min，抽出上层血清，并注入离心管内，-20℃冰箱保存。分别进行血清ALT、MDA检测。肝组织常规HE染色和HSP70免疫组化染色，HSP70指标测定：高倍镜下，细胞浆内呈棕黄色着染者为HSP70蛋白表达阳性细胞，观察切片中10个具有代表性的高倍视野，计算1 000个肝细胞中(100个细胞×10个高倍镜视野)染色阳性细胞数，除以1 000作为HSP70蛋白表达阳性率，并用数码相机成像。

　　15 统计学处理 计量数据以x±s表示，均数间的比较用方差分析。

　　2 结果

　　21 病理学观察 大体观：E组大鼠肝脏表面色泽红润,其他组在阻断肝血流后,左叶及中叶肝脏颜色变成暗红色，质地变软。再灌注24 h后,B组和C组大鼠肝脏基本恢复红润,但与E组仍有明显差异，A组及D组大鼠肝脏表面可见明显的点状或片状的无复流区，呈花白相间花斑状，质地变硬，且A组的无复流区面积更大。HE染色光镜观察结果：镜下可见E组肝细胞、kupffer细胞及肝窦内皮细胞形态正常;A组和D组肝细胞核大小不一、有多级核分裂相及染色质边集，可见多数肝窦扩张，周围有大量红细胞淤积，肝窦及毛细血管内有微血栓形成，肝细胞排列紊乱，并呈气球样变性，分布不均匀，且A组肝细胞肿胀、变性和坏死的程度和范围大，甚至在镜下难以看到完整的肝小叶结构;B组与C组肝脏组织形态要明显好于A组和D组，肝组织结构破坏轻微，仅见部分肝细胞轻度浊肿、偶有变性、坏死及肝窦间隙少量红细胞淤积，肝小叶结构基本完整，但B组要好于C组(图1)。

　　图1 D组大鼠肝脏HE染色(×400)(略)

　　22 HSP70免疫组化染色结果 HSP70的含量从高到底的排列顺序为C组>B组>D组>A组>E组。除E组外均有染色，其余四组中A组量最低，C组含量最高，B组高于D组(图2)。

　　图2 D组大鼠肝脏HSP70免疫组化染色(×400)(略)

　　23 血清ALT、MDA以及肝组织中HSP70的检测结果 表1。

　　表1 各组血清ALT、MDA、肝组织HSP70水平(略)

　　与B组相比：1)P<005,与C组相比：2)P<005

　　从表中结果分析：(1)ALT和MDA的结果具有明显的正相关联性，二者与HSP70结果呈负相关性;(2)B组和C组中ALT和MDA数值明显低于A组，但高于E组，而HSP70结果恰相反，说明Atomolan和IPC单独应用均对肝脏I/R起保护作用，但不能完全消除I/R的损害因素;(3)C组结果中ALT和MDA数值与B组相比具有显著差异性，说明Atomolan的保护作用强于IPC的效果，但HSP70也明显高于B组，这只能说明HSP70不是唯一的保护性因素;D组结果中ALT和MDA仅低于A组并显著高于其他各组，HSP70含量仅高于A组和E组，说明Atomolan和IPC可能互相拮抗。

　　3 讨论

　　本实验观察到I/R组肝缺血后，反映肝细胞功能损伤程序的ALT及反映OFR含量的MDA均增加，且ALT与MDA呈正相关，说明肝脏损伤程度与OFR水平密切相关〔1，2〕;OFR参与了肝缺血性损伤，I/R后OFR爆发性形成可能是引起肝脏功能与结构损伤的最主要原因。

　　外源性rGSH因分子量较大，很难进入到细胞内，其抗氧化的作用主要在细胞外液中进行。在B组大鼠给予GSH后，肝功中ALT和反映OFR的MDA含量明显减少，同I/R组比较具有显著性差异(P<005)，提示GSH能显著减少OFR的生成，肝I/R损伤早期主要与OFR的大量释放有关，而后期则是与肝内中性粒细胞有关的炎症反应起着重要作用〔3～5〕。GSH减少了OFR生成，且加速其清除，使kupffers细胞损伤减轻，抑制了中性粒细胞的浸润能力，故肝脏损伤明显减轻，是GSH保护肝I/R损伤的重要机制。

　　我们发现HSP70与ALT、MDA在大体上具有负相关性——HSP70的含量高的组ALT及MDA数值低。HSP70可能是肝脏IPC延迟性保护作用的一个主要因素。HSP70减轻了肝细胞膜的脂质过氧化反应而实现其保护效应，这一结果与以前的大量相关实验结果〔6〕是一致的，能够进一步证明HSP70是肝脏IPC延迟性保护作用的一个主要因素。

　　GSH预处理与IPC可能相互拮抗。虽然GSH与IPC单独应用时均能减轻肝脏I/R时的损伤，但我们发现在本实验结果中C组及B组的ALT、MDA及HSP70含量却均低于D组的情况，各组差异性显著(P<005)，说明在肝脏I/R时联合应用GSH与IPC将会出现相互拮抗的效果。可能的原因是 GSH抑制了IPC产生HSP70的能力，进而影响到IPC的延迟性保护作用。具体为：IPC时产生的OFR爆发可能是触发HSP表达的关键，Tanaka等〔7〕发现，O2诱发了IPC产生HSP70作用，活性氧代谢产物激活PKC从而起到保护作用; Kukreja等〔8〕用SOD可抑制IPC造成的HSP70 mRNA表达的增加，SOD的T1/2短，为6～10 min，故其作用是暂时的，不影响HSP70的转录及其蛋白的表达。 由于SOD分子量较大而难以进入细胞内，所以外源性SOD主要在细胞外起作用，可能的机理是SOD抑制O2侵害，保护了膜的正常结构和功能。同样道理，外源性GSH也不能够直接进入到细胞内，并可与O2反应可以产生O2〔9～11〕，且 T1/2明显长于SOD，约24 h，可能影响HSP70的转录及其蛋白的表达。

　　虽然近年来文献上介绍了很多的肝脏I/R的预处理方法，但由于这方面的机制尚未完全阐明，所以尚未找到一种能够完全消除肝脏I/R损伤的方法。将现有的方法根据可能的机制加以组合，尽量减轻肝脏I/R损伤，不失为一种积极的思路。

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