细胞外调节蛋白激酶介导的脂蛋白（a）促血管平滑肌细胞迁移

　　作者：袁平,潘扬　　作者单位：贵州省人民医院 普外科， 贵州 贵阳

　　【摘要】目的：研究细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)在脂蛋白(a)[Lp(a)]诱导的人血管平滑肌细胞(VSMC)迁移及细胞骨架构建中的作用。方法： 用不同浓度的ERK激酶抑制剂PD98059抑制人VSMC内ERK的活化，再用Lp(a)诱导处理后的细胞，Western blot检测P-ERK的表达，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架构建变化，迁移试验观察VSMC迁移数量的变化。结果： Western blot检测显示PD98059的终浓度在10 μmol/L时，P-ERK表达无明显变化(P>0.05)，从20~40 μmol/L，随其终浓度的逐渐升高，P-ERK的表达逐渐降低(P<0.01)，达到40 μmol/L后，其抑制作用达到高峰。PD98059预处理人VSMC，Lp(a)诱导20 min后，细胞内未见明显的张力纤维、粘着斑及丝状伪足。对照组VSMC迁移细胞数为(78.87±7.43)个，PD98059处理组为(49.20±6.47)个， PD98059处理组较正常对照组明显减少(P<0.01)。结论： Lp(a)诱导的VSMC细胞骨架构建及细胞迁移依赖于ERK的活化。

　　【关键词】 脂蛋白(A); 平滑肌细胞; 血管; 蛋白激酶类; 细胞外调节蛋白激酶

　　ERK Mediated Vascular Smooth Muscle Cell Migration

　　Promoting Effect of Lipoprotein A

　　YUAN Ping， PAN Yang

　　(Department of General Surgery, Guizhou Provincial People′s Hospital, Guiyang 550004, Guizhou, China)

　　[Abstract] Objective: To study the effect of extracellular regulated protein kinases (ERK) in cytoskeleton reorganization and migration of human vascular smooth muscle cells (VSMCs) stimulated by lipoprotein a [Lp(a)]. Methods: The VSMCs treated with different concentrations of ERK kinase inhibitor PD98059 were, then, stimulated by Lp(a) for 20 minutes. The expression of protein ERK (P-ERK ) in VSMCs was detected with Western blotting. The cytoskeletons of these VSMCs were observed with confocal laser scanning microscope, and the number of cells migrated was determined with migration assays. Results: No change of P-ERK expression was detected in VSMCs when treated by PD98059 with the final concentration of 10 μmol/L(P>0.05). Within the range of final PD98059 concentrations of 20 μmol/L to 40 μmol/L, the P-ERK expression in treated VSMCc decreased along with the increasing of the PD98059 concentrations(P<0.01), and the inhibitory peak was at 40 μmol/L of PD98059 group. No filopodia, stress fibers or focal adhesions was found in DD98059 treated VSMCs.The average number of migrating cells in VSMCs of PD98059 treated groups (49.20±6.47) was smaller than that of control group (78.87±7.43) significantly(P<0.01). Conclusion: Lp(a) stimulated cytoskeleton reorganization and cell migration in VSMCs is dependent on the activation of ERK.

　　[Key words] lipoprotein(a); smooth muscle cells; blood vessels; protein kinases; extracellular regulated protein kinases

　　目前已知血浆脂蛋白(a)[Lp(a)]浓度的升高是各种动脉硬化性疾病的危险因素，Lp(a)不仅与其发病有关，还与其严重程度、术后血管再狭窄及闭塞有很大的相关性。Lp(a)的血浆浓度对生活方式改变和药物的调控不敏感，故目前对Lp(a)致病机制的研究已成为研究的热点。现已发现Lp(a)可促进血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移，但其具体机制仍不明确。用ERK激酶抑制剂PD98059抑制人VSMC内的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)活化，探讨ERK在Lp(a)促VSMC迁移中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　Lp(a)，FITC标记的Phalloidin，鼠抗人平滑肌α-肌动蛋白(α-actin)单克隆抗体，DAPI购自美国Sigma公司;免疫组织化学染色(SABC)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;Costar TranswellTM培养板购自美国Corning公司;兔抗人ERK抗体、兔抗人P-ERK抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;PD98059购自Calbiochem公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人脐动脉VSMC的原代培养、纯化、传代及鉴定

　　取剖宫产胎儿的新鲜脐带，分离出脐动脉，剥除脐动脉外膜，刮去内膜，将动脉中膜剪成约1 mm×1 mm×1 mm的组织块进行培养。传代过程中采用差速贴壁法进一步纯化细胞，第5~10代细胞用于实验[1]。倒置相差显微镜下观察细胞形态，进行形态学鉴定。SABC法检测VSMC胞浆内的α-actin。

　　1.2.2 抑制剂阻断Lp(a)诱导的ERK活化

　　1.2.2.1 实验分组 取第5~10代细胞，用不含或含Lp(a)[即为1、2组，Lp(a)终浓度为320 mg/L]培养液诱导6 h;用含PD98059(终浓度分别为10、20、30、40及50 μmol/L，依次为3~7组)的培养液预处理1 h后，再用含Lp(a)(终浓度为320 mg/L)培养液诱导6 h。

　　1.2.2.2 Westernblot印记检测ERK及P-ERK蛋白表达 0.25 %胰酶消化收集上述处理好的细胞后提取总蛋白并用BCA检测法进行蛋白浓度的测定。将蛋白电泳后转膜，用5%脱脂奶粉TBST液浸泡过夜，以封闭PVDF膜。按说明书与一抗及二抗结合后行ECL发光检测，对胶片进行扫描，用Totallab软件分析。

　　1.2.3 抑制剂阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的细胞骨架的标记及观察 实验分2组，分别为对照组及PD98059处理组，向驯化至同一代谢水平的VSMC加入不含或含PD98059(终浓度为40 μmol/L)培养液孵育1 h后，予Lp(a)诱导20 min，免疫荧光标记细胞骨架，激光共聚焦显微镜观察细胞骨架构建。

　　1.2.4 抑制剂阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的VSMC迁移试验 实验分2组，分别为对照组及PD98059处理组，ERK抑制剂预处理人血管平滑肌细胞后予Lp(a)诱导，Transwell小室检测VSMC迁移。细胞以DAPI染色30 min，每组随机取5个视野，200倍视野免疫荧光显微镜下计数细胞数，取平均值。上述迁移实验重复3次。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS10.0软件对上述结果进行分析，统计数据以均数±标准差来显示，组间比较采用单因素方差分析，两组比较用t检验，P<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 平滑肌细胞的鉴定

　　倒置相差显微镜观察可见平滑肌细胞呈长梭形，呈现典型的“波峰”与“浪谷”状。免疫组织化学进行平滑肌细胞表型标志物α-actin染色，可见细胞胞浆呈棕黄色, 胞核呈淡蓝色，证明培养的细胞是平滑肌细胞。

　　2.2 抑制剂对Lp(a)诱导的P-ERK蛋白表达的影响

　　Western blot检测显示各组VSMC内的ERK蛋白表达量之间无明显差异(P>0.05)，故以ERK的蛋白表达量作为内参照。第2组较第1组P-ERK/ERK比值明显升高(P<0.01);除第2组与第3组之间和第6组与第7组之间的P-ERK/ERK比值无明显差异(P>0.05)外，其余3~6组P-ERK/ERK比值两两之间均有显著性差异(P<0.01)。见图1。

　　2.3 抑制剂阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的细胞骨架构建状况

　　PD98059处理组与对照组相比，细胞内未见明显的张力纤维、丝状伪足(图2及图3)以及粘着斑形成(图4及图5)。注：(1)：与前1组相比，P<0.01;(2)：与前1组相比，P>0.05

　　2.4 抑制剂阻断ERK的活化后Lp(a)诱导的VSMC迁移

　　VSMC迁移试验显示，正常对照组VSMC迁移细胞数为(78.87±7.43)个，PD98059处理组为(49.20±6.47)个， PD98059处理组较正常对照组明显减少(P<0.01)。

　　3 讨论

　　Lp(a)是1963年由挪威遗传学家Berg[2]首先从血浆中分离出来并命名的。此后经一系列研究证明人Lp(a)与动脉粥样硬化有关的各类疾病有密切关系，是动脉粥样硬化、动脉再狭窄、卒中、冠心病及心肌梗死发生的一个主要危险因素，并与其它血脂水平无相关性，是一个独立的危险因素[3]。血液中Lp(a)的浓度是一个稳定的遗传标志，不受性别、年龄、饮食、理化因素及多种降脂药物影响。Lp(a)的致动脉粥样硬化作用机制有以下几个方面：Lp(a)能破坏受体介导的血管内皮舒张功能，导致内皮功能失调;Lp(a)可能通过清道夫受体途径、LDL受体途径及非受体途径等穿过血管内皮，参与泡沫细胞形成;Lp(a)和纯化的Apo(a)可促进VSMC迁移和增值;Lp(a)有促血栓形成作用。一系列研究证实了VSMC从中层向内膜的迁移是动脉粥样硬化和血管再狭窄共同的病理基础[4]。但Lp(a)促VSMC迁移的机制目前仍不明确。

　　细胞骨架是细胞质内由蛋白质组成的三维网架状结构, 分为微管、微丝、中等纤维和微梁网格等，是参与介导细胞变形、细胞运动及细胞迁移等重要活动的蛋白质体系[5]。该体系由肌动蛋白、肌球蛋白和肌动蛋白结合蛋白组成。其中肌动蛋白是最丰富的蛋白，是构成微丝的基本成分，故微丝又称为肌动蛋白细胞骨架系统，其基本结构单位是纤维状肌动蛋白(F-actin)。张力纤维及丝状伪足即是显微镜下的F-actin呈现出的形态。本实验中采用免疫荧光标记F-actin来观察这些结构的构建。

　　ERK包括ERK1和ERK2，统称为ERK1/2，主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢、血清及佛波酯等外界刺激而激活。ERK1/2是由Boulton等[6，7]于上世纪90年代初期分离鉴定的，相对分子量分别为44 kD和42 kD，它们有90%的同源性。ERK1/2的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，ERK1/2信号通路(Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2)是经典的MAPK信号转导途径，是由1个小GTP蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白组成的级联反应。平时ERK1/2位于胞浆内，一旦被激活，ERK1/2迅速穿过核膜，活化的ERK1/2可磷酸化多种核转录因子如Elk-1、Ets-1、c-Myc、Sapla、Tal、STAT、Fos 、ATF2、Max、c-jun及ATF2等，这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终调节细胞代谢和功能，影响细胞产生特定的生物学效应[8]。有研究表明，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的VSMC增殖作用可能与调节G蛋白偶联受体，启动Ras→Raf→ MEK1/2→ERK1/2通路有关。Yang等[9，10]等研究发现，Ox-LDL在导致培养VSMC增殖的同时，伴随MAPK的活化，并可诱导ERK1/2的活化，同时ERK1/2的特异阻断剂U0126可完全抑制Ox-LDL诱导的VSMC的增殖。Ox-LDL对ERK1/2活性的影响，提示Ox-LDL诱导VSMC的增殖极有可能是通过活化ERK1/2这一信号通路而实现的。Hu等[11]研究发现，球囊损伤后早期血管组织ERK1/2活性升高，同时伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高;在损伤后7～14 d，内膜的ERK1/2仍然升高，并且内膜高于中膜，提示ERK1/2活性和2种癌基因表达的增加可能参与了再狭窄过程。最近Fisher等[12]观察到了ERK1/2反义寡核苷酸(ODNs)对VSMC增殖和(或)迁移的抑制作用，因而认为在细胞外基质(ECM)所诱导的VSMC迁移和增殖过程中，ERK1/2是发挥了重要作用的关键信号分子。PD98059是MEK的一种药理学抑制剂，PD98059通过选择性抑制MEK1/2的激酶活性，阻止Raf对ERK1/2的磷酸化和激活。

　　本实验结果显示，各组的总ERK蛋白表达量之间无明显差异(P>0.05)，提示Lp(a)是通过ERK的磷酸化而不是使ERK的表达增加来发挥作用的。VSMC经不同浓度的PD98059预处理后，Western blot检测显示PD98059的终浓度在10 μmol/L时对ERK激酶无明显抑制作用，从20 μmol/L开始，随其终浓度的逐渐升高，其对ERK激酶的抑制作用逐渐增强，但达到40 μmol/L后，其抑制作用达到高峰，40 μmol/L和50 μmol/L对ERK激酶的抑制作用无明显差异，这一结果与Dario等[13]的发现一致。PD98059的终浓度为40 μmol/L时P-ERK的蛋白表达量减少了71.7%，显示了PD98059对Lp(a)诱导的P-ERK蛋白的表达有显著的抑制作用。

　　激光共聚焦显微镜观察PD98059抑制ERK磷酸化后Lp(a)诱导的细胞骨架构建的变化，显示Lp(a)诱导VSMC 20 min后，细胞内未见明显的张力纤维、丝状伪足以及粘着斑形成。说明P-ERK参与了Lp(a)所诱导的张力纤维、丝状伪足以及粘着斑的形成，MAPK是Lp(a)诱导细胞骨架构建的信号通路中的重要一环。VSMC迁移试验显示抑制ERK的磷酸化可明显抑制Lp(a)所诱导的VSMC迁移。但Lp(a)促VSMC迁移信号通路中的其它具体环节仍有待进一步研究。

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