结肠癌组织肿瘤相关巨噬细胞VEGF-C /D的表达及与淋巴

　　作者：李焱1,蒋勇1,史立群2,史爱学2　　作者单位：第三军医大学西南医院:1肿瘤科,2病理学研究所,重庆400038

　　提　要:目的　了解结肠癌肿瘤相关巨噬细胞中VEGF-C/D的表达,探讨其对结肠癌淋巴结转移的影响及可能机制。方法　采用特异的巨噬细胞标记物CD68等抗体以免疫组化染色的方法,并用双染、连续切片对比等对45例结肠癌标本中巨噬细胞VEGF-C/D的表达进行检测,同时行巨噬细胞计数,并统计分析两者间存在的关系。结果　在结肠癌相关巨噬细胞中检测到两种淋巴管生成因子的表达。统计分析显示VEGF-C表达与巨噬细胞计数具有相关性。有淋巴结转移者VEGF-C阳性细胞率高于无转移组。结论　结肠癌肿瘤组织中,不仅肿瘤细胞可分泌表达VEGF-C/D,肿瘤相关巨噬细胞也可表达VEGF-C/D。肿瘤相关巨噬细胞可通过诱导结肠癌局部淋巴管生成,对肿瘤的转移可起到一定的作用。

　　关键词: VEGF-C; VEGF-D;肿瘤相关巨噬细胞;结肠癌

　　中图法分类号:R392. 2;R73-37;R735. 35　　　文献标识码:A

　　Correlation between VEGF-C /D expressions in tumor associated macrophages andlymph nodemetastasis incolon cancerLIYan1,JIANG Yong1,SHI Li-qun2,SHI Ai-xue2,PENG Yi-liang1,LIANG Hou-jie1(1Department ofOncology,2Department ofPathology,SouthwestHospital,Chongqing 400038,China)

　　Abstract:Objective　To discuss the correlation between theVEGF-C/D expressions in tumorassociatedmacrophage(TAM)and lymph node metastasis in colon cancer.Methods　Forty-five colon cancersamplesproven pathologically to be adenocarcinoma were stained by immunohistochemicalmethod forVEGF-C/D andCD68. The correlation ofVEGF-C/D expressions,macrophage counting and lymphnodemetastasiswere ana-lyzed statistically.Results　The expressions ofVEGF-C/D were detected inTAMs. VEGF-C expression was

　　obviously higher in the sampleswith lymphatic metastasis. VEGF-C expression in colon cancerwasrelated tothe number ofTAMs.Conclusion　TAMs are important in the lymph node metastasis,because theycan ex-pressVEGF-C/D and affect the lymphangiogenesis of colon cancer.

　　Key words:VEGF-C;VEGF-D;tumor associatedmacrophage;colon cancer

　　结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一,淋巴道转移是其最常见的转移方式。虽然肿瘤淋巴道转移的具体机制目前仍不十分清楚,但有报道肿瘤内浸润的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤的转移有一定影响[1]。在本研究中,我们运用免疫组织化学的方法,检测了结肠癌组织中淋巴管生成因子VEGF-C/D在肿瘤相关巨噬细胞中的表达,探讨肿瘤相关巨噬细胞在结肠癌淋巴道转移中的作用及其机制。

　　1　材料与方法

　　1. 1　一般资料

　　收集2003-2004年在西南医院普通外科行外科手术切除的结肠癌标本45例,全部为腺癌,均经病理检查证实。术前患

　　者未行任何治疗。其中男性31例,女性14例,年龄34~72岁,平均52. 8岁。有淋巴结转移的27例。肿瘤分化程度:高分化

　　17例,中分化21例,低分化7例。另取5例正常结肠组织为对照。标本经常规脱水、10%甲醛固定、石蜡包埋,连续切片(片厚4μm)。

　　1. 2　试剂

　　兔抗人VEGF-C多克隆抗体、鼠抗人CD68单克隆抗体,DAB显色试剂盒, S-P9000免疫组化染色试剂盒均购于北京中

　　杉生物技术有限公司。兔抗人VEGF-D多克隆抗体。双染试剂盒购于北京中杉生物技术有限公司。

　　1. 3　方法

　　1. 3. 1　巨噬细胞分布、计数　　采用巨噬细胞特异抗体CD68进行染色,巨噬细胞计数采用盲法进行,参考Schoppmann等[2]的方法。低倍镜下选取染色最密集的视野,高倍镜下进行计数,每例计数3个视野,并求平均值。分别计数肿瘤边缘区域和中心区域的巨噬细胞。

　　1. 3. 2　VEGF-C/D表达的检测　　VEGF-C/D单染采用常规S-P法进行,表达的分析采用每个切片采集5个视野,用Image-Pro Plus(Media Cybernetics Inc. USA)图像分析系统测算其单位面积平均光密度值[2, 3]。巨噬细胞表达VEGF-C采用LAB-SA双染法,行CD68和VEGF-C染色。VEGF-C显色呈紫色,CD68显色呈红色。巨噬细胞表达VEGF-D采用连续切片分别染色CD68与VEGF-D抗体,并在同一位置进行对比,判断巨噬细胞是否表达VEGF-D。染色操作均按抗体及试剂盒说明书严格进行。苏木精复染,脱水透明,中性树胶封闭。

　　1. 4　统计学处理

　　采用SPSS 10. 0统计软件。VEGF-C/D表达情况用χ2检验。VEGF-C/D表达与巨噬细胞计数间的关系采Spearman

　　相关分析。

　　2　结果

　　2. 1　肿瘤相关巨噬细胞分布及计数

　　以巨噬细胞表面标志CD68作为标记物检测其在肿瘤中的分布并计数,CD68阳性呈棕黄色,位于细胞质和细胞膜。在各

　　肿瘤组织周围和内部均可看到大量巨噬细胞浸润,以肿瘤周围浸润较明显。

　　2. 2　VEGF-C/D表达与巨噬细胞计数的关系

　　VEGF-C/D阳性染色位于细胞质中。不仅肿瘤细胞表达VEGF-C、D,间质细胞也有表达,在肿瘤周围正常组织中则基本

　　没有表达。二者中以VEGF-C表达多见,阳性率达60%,VEGF-D阳性率为28. 9%。而且可以从VEGF-C和CD68的双染图像(图1)及连续切片的对比(图2)中看出,肿瘤相关巨噬细胞可表达VEGF-C/D。CD呈红色位于细胞质及细胞膜,VEGF-C呈紫色位于细胞质

　　图1　结肠癌肿瘤相关巨噬细胞中VEGF-C的表达

　　(S-P×400)

　　A:结肠癌标本连续切片中巨噬细胞分布;B:结肠癌标本中连续

　　切片中VEGF-D的分布

　　图2　结肠癌肿瘤相关巨噬细胞VEGF-D的表达　(S-P×200)

　　在检测的结肠癌标本中,经Spearman统计分析, VEGF-C表达与巨噬细胞计数正相关(r=0•418,P=0•043)。巨噬细胞浸润明显的肿瘤中VEGF-D表达也较多,但VEGF-D表达与巨噬细胞计数相关性不显著(P>0•05)。

　　3　讨论

　　VEGF-C/D作为目前比较明确的淋巴管生成因子,其在肿瘤淋巴道转移中的作用已有不少文献报道。通过与其受体VEGFR3的结合,可以促进淋巴管内皮细胞的增殖、增生,诱导淋巴管的生成。而肿瘤组织中的淋巴管生成,必然可以增加肿瘤细胞进入淋巴管的几率,从而影响到肿瘤的淋巴结转移及预后。我们前期的研究结果显示结肠癌组织中VEGF-C/D表达较正常组织增加,有淋巴结转移的病例中,其VEGF-C表达也较多[4],这与国内外研究结果相似[5]。

　　在VEGF-C/D表达细胞种类上,目前已发现多种细胞可在适当的刺激因子下表达分泌这两种因子[6, 7]。在肿瘤局部微环境中,不仅细胞种类多,而且存在多种生物活性因子,其中巨噬细胞作为一种重要的炎症反应细胞,在肿瘤所处微环境中也是比较常见的细胞种类,可达到肿瘤组织细胞总数的一半[8],而且本身也可以表达多样的活性因子,因此它在肿瘤局

　　部所起作用是不能忽视的。但其在淋巴管生成方面的作用,近年来的相关发现并不多。

　　Cursiefen等[9]在利用动物角膜模型研究VEGF-A对血管、淋巴管生成作用时,发现VEGF-A可诱导巨噬细胞在角膜聚集,并测得巨噬细胞可分泌VEGF-C,从而诱导角膜内淋巴管生成。当去掉局部单核细胞、巨噬细胞后,淋巴管生成现象消失。Schoppmann等[2]在研究人宫颈癌时,也发现部分肿瘤相关巨噬细胞可表达VEGF-C/D及其受体VEGFR3,其密度与肿瘤局部淋巴管密度显著相关。国内冯红超等[10]也发现在口腔鳞癌中,不仅肿瘤细胞,而且肿瘤相关巨噬细胞也可分泌VEGF-C,并认为肿瘤相关巨噬细胞在瘤周的淋巴管生成和淋巴结转移中可能起到重要作用。

　　结肠癌组织肿瘤相关巨噬细胞VEGF-C/D的表达及与淋巴结转移的关系

　　本实验结果,经统计分析也显示VEGF-C表达与巨噬细胞计数相关。同时通过双染及图像对比等方法,也证实结肠癌组织中的巨噬细胞有VEGF-C/D的表达。肿瘤大多存在炎症反应,肿瘤周围更明显。IL-1β、TNF-α等炎症前期细胞因子可刺激VEGF-C的表达,而巨噬细胞作为一种重要的炎症反应细胞,它可以分泌大量、多种的炎症因子。因此它在肿瘤周边的大量浸润及分泌,必然可以通过自分泌或旁分泌刺激自身、肿瘤细胞产生淋巴管生成因子,而且是肿瘤周边高于内部。

　　本实验结果中,VEGF-D在表达量、阳性细胞比率都比较低,统计学分析表明VEGF-D和淋巴结转移等因素无明确关系,但不能由此否定其在淋巴管生成中的作用,因为毕竟存在实验样本量偏少、假阴性等因素的干扰。因此对于它在肿瘤局部微环境中所起的作用还需要进一步的研究。

　　总之,实验显示结肠癌肿瘤相关巨噬细胞可分泌表达VEGF-C、D,加之可通过自身分泌的其他因子影响到肿瘤细胞淋巴管生成因子的表达,对结肠癌局部淋巴管生成及转移可起到重要的作用。

　　参考文献:

　　[1]冯红超,宋宇峰.口腔鳞癌中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和血管生成与淋巴结转移的关系[J].临床口腔医学杂志, 2003,19(3):135-137.

　　[2] Schoppmann SF, BirnerP, StocklJ,etal. Tumor-associatedmacrophagesexpress lymphatic endothelialgrowth factors and are related to peritumorallymphangiogenesis[J]. Am JPatho,l 2002, 161(3): 947-956.

　　[3]逄小红,田　铧,刘执玉,等. VEGF-C在食管鳞癌和神经胶质瘤中的表达及其意义[J].癌症, 2003, 22(11): 1166-1169.

　　[4]李　焱,蒋　勇,史立群,等. HMGB1和VEGF-C /D在结肠癌组织中的表达及与淋巴结转移之间的关系[ J].第三军医大学学报,2006, 28(11): 1237-1239.

　　[5] Kajita T, OhtaY, KimuraK,et al. The expression of vascular endo-thelial growth factor C and itsreceptors in non-small cell lung cancer[J]. Br JCancer, 2001, 85(2): 255-260.

　　[6] Trompezinski S, Berthier-VergnesO, DenisA,etal. Comparative ex-pression of vascular endothelialgrowth factor familymembers, VEGF-B,-C and-D, by normalhuman keratinocytes and fibroblasts[J]. ExpDermato,l 2004, 13(2): 98-105.

　　[7] OrlandiniM, OlivieroS. In fibroblastsVegf-D expression is induced bycell-cell contactmediated bycadherin-11 [ J]. J Biol Chem, 2001,276(9): 6576-6581.

　　[8] CollingridgeD R, HillSA, ChaplinD J. Proportion of infiltrating IgG-binding immune cells predictfor tumour hypoxia[ J]. Br J Cancer,2001, 84(5): 626-630.

　　[9] Cursiefen C, Chen L, Borges L P,et al. VEGF-A stimulates lym-phangiogenesis andhemangiogenesisin inflammatory neovascularizationviamacrophage recruitment[J]. J Clin Invest, 2004, 113(7): 1040-1050.

　　[10]冯红超,宋宇峰,温玉明.口腔癌组织中血管内皮生长因子-C在肿瘤相关巨噬细胞内的表达及与淋巴结转移的关系[J].癌症,2004, 23(3): 278-281.