环氧合酶-2与血管内皮生长因子C在胃癌中的表达及临床意义

　　作者：梁振家　　作者单位：防城港市第一人民医院普外科，广西 防城港

　　【摘要】目的：探讨血管内皮生长因子C (VEGF-C)和环氧合酶-2(COX-2) 的表达在胃癌的发生、发展及预后的临床意义。方法：采用S-P免疫组织化学方法，检测VEGF-C和COX-2在胃镜活检的正常胃黏膜(n=17)、浅表性胃炎(n=19)、萎缩性胃炎/肠化生(n=22)、胃黏膜不典型性增生(n=23)和胃癌患者1期(n=18),2期(n=24),3期(n=22),4期(n=18)的胃组织。结果：胃癌组织中的VEGF-C和COX-2的表达阳性率明显高于非胃癌组织，正常胃黏膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎/肠化生、胃黏膜不典型性增生至胃癌逐级之间的差异有统计学意义(P<0. 05);在3及4期胃癌中的表达阳性率明显高于1及2期(P<0.05);VEGF和COX-2的表达具有显着相关性(P<0.01)。结论：VEGF-C和COX-2的共同表达在胃癌的发生发展可能起重要作用，联合检测VEGF-C和COX-2对胃癌的早期诊断、临床防治及预后可能具有重要临床价值。

　　【关键词】 胃癌,环氧合酶-2,血管内皮生长因子-C

　　[ABSTRACT] Objective： To explore the expression of VEGF-C and COX-2 and their clinical significance in occurrence， development and prognosis of gastric cancer. Methods： Expressions of VEGF-C and COX-2 were determined by S-P immunohistochemical staining analysis in stomach tissue of normal gastric mucosa(n=17)，atrophic gastritis(n=19) ，superficial gastritis(and/or atrophic gastritis)(n=22)，gastric mucosa not typical hyperplasia(n=23) and gastric cancerⅠ period (n=18)， gastric cancerⅡ period(n=24，)gastric cancerⅢ period(n=22) and gastric cancerⅣ period(n=18). Results：The positive rates of VEGF-C and COX-2 were significantly higher in gastric cancer tissue than in tissue without gastric cancer. There were significant difference in expressions of VEGF-C and COX-2 among normal gastric mucosa，atrophic gastritis，superficial gastritis( and/or atrophic gastritis)，atypical hyperplasia gastric mucosa and gastric cancer tissue (P<0.05). The positive rate was significantly higher in stage 3 and 4 than stage 1 and 2 (P<0.01). The expression of VEGF-C was significantly correlated with expression of COX-2 (P<0.01). Conclusions： Co-expression of VEGF-C and COX-2 may play an important role in the occurrence and development of gastric cancer. Combined detection of VEGF-C and COX-2 is valuable in early diagnosis， prevention， treatment and prognosis of gastric cancer

　　[KEY WORDS] Gastric cancer; C yclooxygenase-2; Vascular endothelial growth factor C

　　胃癌(gastric Cancer， GC)是我国最常见的消化道恶性肿瘤，死亡率居各种恶性肿瘤的前列[1]，和绝大多数肿瘤一样，胃癌也是由多种因素参予的一种渐进积累转化性疾病，其中肿瘤血管生成是胃癌发生、发展最重要的因素。环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2， COX-2)与血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth faetor C， VEGF-C)均有促进肿瘤血管生成的作用，文献[2-4]表明：两者在胃癌组织标本中都有高水平的表达本实验采用免疫组化方法检测VEGF-C和COX-2在胃癌及非癌变胃组织中的表达情况，结合临床病理资料，探讨VEGF-C和COX-2在胃癌发生发展中的作用及其相关性。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料

　　随机选取2007年8月～2010年7月在普外科就诊，胃镜检查和组织活检病理诊断为正常胃黏膜组织者17例 (男性10例，女性7例)，平均年龄(51.3±6.8)岁;浅表性胃炎19例(男性9例，女性10例)，平均年龄(52.5±5.2)岁; 萎缩性胃炎/肠化生22例(男性10例，女性12例)，平均年龄(54.2±4.1)岁;胃黏膜不典型性增生23例 (男性13例，女性10) 例，平均年龄(54.6±7.7)岁;胃癌82例，根据国际抗癌联盟(UICC)关于胃癌TNM分期方法[5]进行临床分期：1期18例(男性9例，女性9例)，平均年龄(54.7±8.5)岁;2期24例 (男性10例，女性14例)，平均年龄(55.2±7.4);3期22例(男性13例，女性9例)，平均年龄(56.1±6.9)岁;4期18例(男性10例，女性8例)，平均年龄(5,6.4±8.3)岁。各组在性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2　主要试剂

　　兔抗人COX-2、VEGF-C克隆抗体购自Santa Cruz公司产品， S-P免疫组织化学染色试剂盒、DAB显剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3　免疫组化方法

　　所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、作5 μm厚切片，隔5片取1片，每个标本取5片。严格按照试剂盒提供的说明书操作：将组织切片置烤箱60 ℃烤片1 h，使组织在玻片上展开并紧密贴附，切片脱蜡至水，采用常规S-P法染色，每个步骤均用PBS冲洗3 min/次，冲洗3次，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性10 min，柠檬酸盐缓冲液中高压修复;山羊血清，室温孵育封闭组织中非特异性抗原20 min，加一抗，以PBS代替一抗作为阴性对照， 37 ℃孵育2 h;滴加生物素标记的二抗，室温孵育10 min，滴加IgG抗体-辣根过氧化物酶多聚体， 37 ℃孵育10 min，应用DAB溶液显色5～10 min，复染，脱水，透明;中性树胶封片，显微镜下观察。光镜下(×100倍)选取染色清晰的5个视野，分别取上、下、左、右及中心共5个区域进行细胞计数，再在高倍镜(×200倍)下观察，每个区计数200个细胞，共计数1 000个细胞，计算阳性细胞所占百分比。

　　1.4　免疫组化结果判断

　　VEGF-C主要定位于肿瘤细胞的细胞浆，以肿瘤细胞及血管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，COX-2主要定位于细胞浆。参考文献[4]确定本实验的判定标准：依据染色强度和阳性细胞数所占比例来计算评分：细胞膜或细胞浆呈蓝色为0分，淡棕色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，阳性细胞数所占比例(X)： X≤5%记为0分，5%75%为4分。将染色评分与阳性细胞数所占比例评分相加后，≤1分者为阴性表达，≥2分者为阳性表达。

　　1.5　统计学处理

　　用SPSS 16.0统计软件对所得结果进行统计学分析， 计数资料采用两个(或多个)样本率比较的χ2检验， COX-2和VEGF-C的相关性分析采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　VEGF-C与COX-2在胃癌与非胃癌组织中的表达情况

　　VEGF-C在正常胃黏膜组织、浅表性胃炎、萎缩性胃炎/肠化生、胃黏膜不典型性增生、胃癌1期、胃癌2期、胃癌3期、胃癌4期胃黏膜组织中的阳性表达率及统计学分析结果如下：分别为0%、5.26%、20.21%、34.54%、50.18%、64.52%、80.29%和94.44%，逐级之间的差异有统计学意义(P<0.05);在不同胃癌TNM分期的3及4期胃癌中的表达阳性率明显高于1、2期(P<0.05)。

　　COX-2在正常胃黏膜组织、浅表性胃炎、萎缩性胃炎/肠化生、胃黏膜不典型性增生、胃癌1期、胃癌2期、胃癌3期、胃癌4期胃黏膜组织中的阳性表达率及统计学分析结果如下：分别为0%、10.53%、23.67%、41.15%、56.53%、72.74%、87.1%和94.44%。逐级之间的差异有统计学意义(P<0. 05);在不同胃癌TNM分期的3及4期胃癌中的表达阳性率明显高于1、2期(P<0.05)。VEGF-C与COX-2在胃癌与非胃癌组织中的表达对比见表1。表1　VEGF-C与COX-2在胃癌与非胃癌组织中的表达对比

　　2.2　VEGF-C与COX-2之间的相关性

　　Spearman等级相关分析表明：正常胃黏膜组织、浅表性胃炎、萎缩性胃炎/肠化生、胃黏膜不典型性增生、胃癌1期、胃癌2期、胃癌3期、胃癌4期组织中EGFR表达与COX-2之间具有显着相关性(P<0.01)。

　　3　讨论

　　胃癌的形成是一个多阶段、多步骤的过程：从浅表性胃炎、萎缩性胃炎/肠化生、胃黏膜不典型性增生发展为胃癌是胃粘膜表面反复受到损害后导致的一个复杂的结果，其中肿瘤血管的生成是胃癌实体瘤发展、转移的关键步骤，因为恶性肿瘤的发生、生长及其转移必须依赖新生血管持续不断地为其提供营养和排除代谢产物，研究[6-8]表明：COX-2具有促进肿瘤血管生成的作用，COX-2在许多癌前病变和恶性肿瘤表达增强，它与肿瘤的发生、浸润、转移有密切关系，COX-2抑制剂可通过抑制肿瘤血管的生成而具有防治胃癌、结肠癌等实体瘤的作用[9]。COX-2是催化花生四烯酸转化为活性物质前列腺素的关键限速酶[10]，属诱导型酶，静息状态下不表达，COX-2是诱导性表达酶，正常生理状态下在多数组织内检测不到，但当细胞当细胞受生长因子、炎症刺激后，其表达表达上调，催化合成大量的前列腺素E2，从而促进细胞增殖，由于各种刺激因素不一样， COX-2表达的量及分布亦不一样[11,12]，人类多种恶性肿瘤及癌前病变组织中有COX-2的高表达。

　　有研究[4]表明，COX-2与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)的表达呈正相关，与多种实体瘤的侵袭和转移密切相关[13]，COX-2可能是通过VEGF促进肿瘤的生长的，VEGF是重要的血管生成因子，已被证实与恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关[14,15]，VEGF家族控制着血管生成、淋巴管生成、血管通透性以及内皮细胞存活，它通过作用于内皮细胞上的两个酪氨酸激酶受体VEGFR1/Flt-1和VEGFR2/Flk-1/KDR高效地作用于血管内皮细胞，诱导内皮细胞增殖，促进血管形成。VEGF家族中的血管内皮生长因子-C是促进肿瘤侵袭和转移的主要因子，是目前所知的最特异淋巴管生成因子，可以促进淋巴增生和实体瘤的扩散，所以又称淋巴管生成因子，可以刺激血管而且有选择性地介导淋巴管内皮细胞增殖、促进肿瘤淋巴转移，对肿瘤生长起重要调节作用。

　　本研究发现：胃癌组织中的VEGF-C和COX-2的表达阳性率明显高于非胃癌组织和正常黏膜组织，从正常胃黏膜、浅表性胃炎、萎缩性胃炎/肠化生、胃黏膜不典型性增生至胃癌逐级之间的差异有显着性(P<0. 05);在不同胃癌TNM分期的3及4期胃癌中的表达阳性率明显高于1及2期(P<0.05);VEGF-C和COX-2的表达具有显着相关性。胃黏膜不典型性增生属于癌前病变，VEGF-C和COX-2的阳性率(分别为34.54%、41.15%)也显着高于正常胃黏膜(分别为0%、0%)、浅表性胃炎(分别为5.26%、10.53%)、萎缩性胃炎/肠化生组(分别为20.21%、23.67%)，COX-2、VEGF-C组织中的表达均有明显的正相关(P<0.01)，提示它们之间存在着某种内在的联系，结合Su[16]等认为COX-2是通过前列腺素受体EP1和人表皮生长因子受体HER-2/Neu受体上调VEGF-C的表达，而VEGF-C有刺激血管和淋巴管生成的双重作用，VEGF-C通过与其受体血管内皮生长因子受体-3结合诱导肿瘤淋巴管的形成，以及内皮细胞的增殖和迁移，调控血管和淋巴管内皮的新生，进而促进肿瘤的淋巴管生成和淋巴结转移，对肿瘤的生长和转移其重要作用。同时Soumaoro等[17]还发现结肠癌中COX-2表达与VEGF-C和肿瘤微血管密度(microvessel density， MVD)密切相关的研究，本实验结果表明，COX-2、VEGF-C在胃癌的发生、发展和侵袭和转移具有重要作用，VEGF-C和COX-2的共同表达在胃癌的发生发展可能起重要作用，对胃癌的临床防治及判断发生、发展和预后可能具有重要临床价值。

　　在早期，COX-2可能为胃癌的刺激因子;而在胃部肿瘤生成后COX-2又可能通过VEGF-C诱导癌组织内新生血管形成而成为肿瘤细胞侵袭转移的促进因子，故对COX-2和VEGF-C的进一步研究将有助于临床上对肿瘤进行早期预防诊断及预后判断提供更充分的理论依据，而至于COX-2和VEGF-C对胃部恶性肿瘤的形成和发展的具体作用机制有待进一步的研究证实。

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