CRD-BP RNA表达与结直肠癌临床特征相关性分析

　　作者：金晓菲,尹莉,陈官民,王小娟　　作者单位：宁夏医科大学附属医院综合病房，银川

　　【摘要】为了解结直肠癌患者外周血中不稳定编码区结合蛋白(CRD-BP)RNA的表达与患者临床特征的相关性， 应用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应方法检测32例结直肠癌患者和35例对照组人群外周血中CRD-BP RNA的表达。结果结直肠癌组32个样本中有10个样本中检测到CRD-BP RNA表达，阳性表达率31.25%，对照组35个样本中均未检测到CRD-BP RNA表达，两组间阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05);实验组中CRD-BP RNA的表达与临床分期及有无淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结直肠癌患者外周血中CRD-BP RNA表达可能与有无淋巴结转移、临床分期相关。

　　【关键词】 CRD-BP RNA,外周血,直肠癌

　　结直肠癌在全球发病率居第三位、死亡率居第4位[1]。近年来不稳定编码区结合蛋白(Coding Region instability Determinant-Binding Protein，CRD-BP)成为肿瘤学研究的热点。已有研究表明CRD-BP在结直肠癌等多种肿瘤中表达，研究其表达与直肠癌临床特征相关性可以为临床诊断、治疗、判断结直肠癌预后提供帮助。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象和分组

　　结直肠癌患者32例(实验组)，男18 例，女 14例，年龄36～83 岁，平均 62岁。肿瘤病理类型：根据Dukes分期标准进行临床分期：DukesA期7例、DukesB期13例、DukesC期10例、DukesD期2例。分化程度：高分化腺癌9例、中分化腺癌16例、低分化腺7例。术后确定肿块直径≤5cm 18例、>5cm 14例。术后确定有淋巴结转移12例、无淋巴结转移20例。所有标本均来源于宁夏医科大学附属医院，用EDTA.Na2抗凝管采清晨空腹静脉血5mL。

　　对照组共35例， 均选取宁夏医科大学附属医院2006年1月-2006年4月门诊就诊者，其中健康体检者20例，经肠镜活检确诊良性肠道疾病者15例。男18例，女17例，年龄分布22～56岁，中位年龄37岁。

　　1.2 引物、探针的设计与合成

　　CRD-BP RNA引物参照Ross资料设计[2]，采用计算机软件辅助设计，根据引物的设计原则，设计扩增的CRD-BP RNA引物序列为：外引物：上游引物：5’-ATCACTGTGAAGGGGGCCAT-3’(20bp)，下游引物：5’-AGCTATAGGGAGCAGCCCCAG-3’(21bp);内引物：上游引物：5’-GAA TGATGTGGCTGCCATGA-3’(20bp)，下游引物：5’-GACCTACAGCAGCCAGGT TCA-3’ (21bp)。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。按照荧光定量PCR 探针设计要求，设计荧光定量PCR扩增HCV的探针序列为：5’-FAM-CCT GCA GTC TCA CCT GAT CCC TGG C-TAMRA-3’(25bp)， 其中5’标记的荧光发光基团是6-羧基荧光素，3’标记的荧光淬灭基团为四甲基罗达明，探针的合成及5’端标记在中山大学达安基因诊断中心实验室PE394仪上合成，随后进行3’端标记及封闭。探针的纯化采用15%聚丙烯凝胶电泳后割胶分离纯化，纯化后的探针测定其OD值，计算其含量，置-20℃备用。

　　1.3 RNA的提取

　　用淋巴细胞分离液(北京鼎国生物制品公司)自静脉血中分离单个核细胞，采用Trizol(北京鼎国生物制品公司)总RNA提取液“一步法”提取细胞总RNA，加入20μL无RNase水中溶解，取5μL RNA置紫外分光光度计测OD260、OD280及二者比值，计算RNA浓度。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

　　1.4 逆转录反应和PCR扩增

　　各管总反应体积20.0μL。取5μL RNA加入5×逆转录buffer 4.0μL，外上游引物0.4μL，外下游引物 0.4μL，dNTPs 0.2μL，逆转录酶MMLV(20u/μL)1.0μL，DEPC水9.0μL。反应条件：37℃ 反应60min，然后95℃ 灭活3min。

　　1.5 PCR扩增

　　取逆转录产物(cDNA )5.0μL加入5×定性PCR buffer 5.0μL，外上游引物0.5μL，外下游引物 0.5μL，dNTPs 0.3μL，Taq 聚合酶(3 u /μL) 1.5μL，逆转录产物(cDNA )5.0μL，ddH2O 12.2μL。93℃ 变预性2min，在PE9600扩增仪(美国ABI公司)中93℃ 45，55℃ 30s，2℃ 45min，72℃ min 共20个循环。取cDNA(第一轮PCR 产物)5.0μL加入5×定量PCR buffer10.0μL，内上游引物1.0μL，内下游引物1.0μL，dNTPs 0.5μL，荧光探针1.0μL，Taq 聚合酶(3u/μL)1.5μL，ddH2O 30.0μL。在PE7300扩增仪(美国ABI公司)中93℃ 2min ，93℃ 45s，55℃ 45s，共40个循环。每份标本同时检测β-actin(扩增片段大小为220bp)作内参照，β-actin 阳性为有效标本。每次实验均设阴性对照和阳性梯度对照。实验结果由电脑自动保存并分析。

　　1.6 PCR产物的凝胶电泳检测

　　CRD-BP 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(3-4V/cm，40min)，用凝胶扫描系统(UVP-GDS-8000)观察。

　　1.7 统计学方法

　　本实验资料采用SPSS 11. 5统计软件，阳性率之间比较采用χ2检验， P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RNA 的提取质量和纯度

　　取总RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳，可见28s、18s二条清晰的条带和稍欠清晰的5s条带(图1)，说明提取的RNA样品纯度较高，完整性较好，无DNA污染，无降解。

　　2.2 CRD-BP RNA在结直肠癌患者及对照组的表达及相关分析

　　CRD-BP RNA在32例结直肠癌患者(术前)外周血中的阳性表达率为31.25%，20例健康人外周血中的阳性表达率为0.00%，15例良性肠道疾病患者外周血中的阳性表达率为0.00%，CRD-BP RNA的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 CRD-BP RNA 的表达与结直肠癌患者临床特征的关系

　　见表1。表1 CRD-BP RNA 的表达与结直肠癌临床特性的关系(略)

　　CRD-BP RNA在结直肠癌患者外周血中的表达与患者的年龄、性别无相关性(P>0. 05);CRD-BP RNA在盲肠、结肠、直肠中的阳性表达率、在不同大小肿瘤中的阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。

　　2.4 CRD-BP RNA的表达与结直肠癌患者病理学特征的关系

　　见表2。表2 CRD-BP RNA的表达与结直肠癌临床特征的关系(略)

　　CRD-BP RNA在高、中、低分化腺癌中的阳性表达率差异无统计学意义(P> 0. 05)。浸润浆膜内和浆膜外的CRD-BP RNA表达率差异也无统计学意义(P>0. 05)。CRD-BP RNA在有、无淋巴结转移患者外周血中的阳性表达率差异有统计学意义(P<0. 05)。在32例结直肠癌患者中，A+B期CRD-BP RNA 阳性表达率低于C+D期(P<0. 05)。其中C期阳性表达率为40%(4/10)，D期中阳性表达率为100%(2/2)。

　　3 讨论

　　c-myc基因最早是 1982年Neel[3]于禽类骨髓瘤病毒MC29中发现的一种癌基因，其定位于 8q24区， 由3个外显子和2个内含子组成。通常c-myc mRNA半衰期是15～30min，在某些细胞中它的半衰期却长达2h或更长。1992年Berstein PL[4]等国外学者发现c-myc mRNA有一段RNA片段(CRD)，它对c-myc mRNA的稳定性有很大影响，并且发现它和一个分子量约70kD的多聚核糖体联合的蛋白结合，从而使c-myc mRNA稳定。CRD区是影响c-myc半衰期的主要因素及转录后调节的一种重要因素[5]。Berstein PL[4]等发现一个约70kD的多聚核糖体联合的蛋白(CRD-BP)在正常情况下和c-myc编码区决定子结合并保护mRNA的这个区域不被核酸内切酶分解，使得c-myc mRNA稳定、半衰期延长、c-myc 蛋白表达上调。CRD-BP是一个遮蔽蛋白、癌胚蛋白，其主要功能是与c-myc mRNA的CRD区特异性结合，阻止c-myc mRNA被核酸内切酶分解，使得c-myc mRNA稳定、半衰期延长，c-myc 蛋白表达增加，从而使得细胞的性质发生变化。近年的研究发现CRD-BP还可以和n-myc RNA、β-actin mRNA及 H19 RNA等结合， 影响细胞的增殖分化。CRD-BP受生长发育调节，正常情况下，CRD-BP只在胚胎组织中表达，在成体组织中表达被抑制[6]。在原始肿瘤和不同来源的变异细胞系中重新被激活，可以检测到其表达[7]，但其激活的机制目前还不明确。

　　既往的研究发现，CRD-BP是一个癌胚蛋白[8]，在乳腺癌、小细胞肺癌、结直肠癌中表达或过表达，有可能成为新的肿瘤标志物。2001年Ross J等[9]从21个病人中成对地采集癌组织和正常结肠样本，应用免疫杂交技术和(或)逆转录PCR方法，在其中17例样本中一或两种方法检测到CRD-BP阳性，除1例外，正常结肠样本CRD-BP阴性，CRD-BP肠道炎性和绒毛状腺瘤样本也未检测到CRD-BP。刘光军[10]等RT-PCR检测法检测大肠癌和大肠腺瘤组织，结果表明CRD-BP的表达可能在成年大肠癌病人中被重新激活，显示其与细胞异常增生相关。王方金[8]利用巢式荧光实时RT-PCR，在43. 8%的结直肠癌患者的外周血中检测到CRD-BP RNA的表达，在对照组中均未检测到表达，而CRD-BP RNA的表达与结直肠癌的Dukes分期有相关性。

　　本研究运用FQ-nRT-PCR方法探讨了32例结直肠癌患者外周血中CRD-BP RNA的表达情况，结果表明CRD-BP RNA在结直肠癌中的阳性表达率显著高于健康人和良性结直肠疾病患者，此结果与王方金的试验结果相比阳性率较低，可能与本试验样本数量较小有关。实验中CRD-BP RNA的表达与患者性别、年龄、发病部位、肿瘤类型、肿瘤大小等临床特征无关，与结直肠癌患者临床分期相关。A+B期结直肠癌外周血中阳性率为15%(3/20)，C+D期的结直肠癌外周血阳性表达率为58.3%(7/12)，其中C期阳性率为40%(4/10)，D期阳性率100%(2/2)，这与王方金的结果相近;CRD-BP RNA在有淋巴结转移的结直肠癌患者外周血中的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组，以上结果提示，CRD-BP RNA有可能成为新的结直肠癌肿瘤指标用于临床诊断;CRD-BP RNA不仅通过延长c-myc mRNA半衰期，促进结直肠癌细胞的恶性转化，而且还可能参与结直肠癌细胞转移过程的调节，在转移过程中起作用，有可能成为结直肠癌预后指标。

　　【参考文献】

　　[1]Weitz J， Koch M， Debus J， et al. Colorectal cancer[J]. Lancet， 2005， 365:153.

　　[2]Ross J， Lemm I， Berberet B. Overexpression of an mRNA-binding protein in human colorectal cancer[J]. Oncogene， 2001， 20(45):6544-6550.

　　[3]Neel BG. Two human c-oncgens are located on the long arm of chromosome[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1982， 79(24):7842-7844.

　　[4]Bernstein PT，Herrick DJ，Prokipcak RD，et al. Control of c-myc mRNA half-life in vitro by a protein capable of binding to a coding region stability determinant[J]. Cenes Dev，1992，6(4)：642-654.

　　[5]Prokipcak RD，Herrick DJ，Ross J. Purificatus and properties of a protein that binds to the C-terminal coding region of human c-myc mRNA[J]. J Biol Chem， 1994， 269(12)：9261-9269.

　　[6]Leeds P，Kren BT，Boylan JM，et al. Developmental regulation of CRD-BP， an RNA- binding protein that stabilizes c-myc mRNA in vitro[J]. Oncogene， 1997， 14(11): 1279- 1286.

　　[7]Ioannidis P， Mahaira L， Papadopoulou A， et al. CRD-BP: a c-Myc mRNA stabilizing protein with an oncofetal pattern of expression[J]Anticancer Res， 2003， 23(3A):2179- 2183.

　　[8]王方金， 何蕴韶，张常华，等. 巢式荧光实时RT-PCR检测结直肠癌患者外周血中CRD-BPmRNA[J]. 临床检验杂志，2005，23(2)：120-122.

　　[9]Ross J， Lemm I， Berberet B. Overexpression of an mRNA-binding protein in human colorectal cancer[J]. Oncogene， 2001， 20(45):6544-6550.

　　[10]刘光军， 尤振宇， 常毅，等. CRD-BP基因在大肠肿瘤中的表达[J]. 沈阳部队医药，2005， 18(4): 229-230.