新疆维吾尔族与汉族直肠癌组织APC基因突变分析

　　作者：范川文,库热西•玉努斯　　作者单位：1新疆医科大学附属肿瘤医院胃肠外科， 2新疆地方病分子生物学重点实验室, 新疆乌鲁木齐

　　【关键词】 新疆维吾尔族,汉族,直肠癌 组织 APC基因突变

　　Abstract:　Objective: 　To explore the relationship between the APC gene mutation and the clinicopathological significance in rectal cancer of the Xinjiang Uygur and Han. Methods: 　 The mutations in mutation cluster region (MCR) of APC gene was detected by the polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism (PCRSSCP) methad in 70 cases of the Xinjiang region with primary rectal adenocarcinoma and the normal mucosal tissues. Results: 　There was no association between clinicopathologic factors and the APC gene mutation. No statistical difference was found in different ethnic groups. Conclusion: 　There was no correlation between the mutation of APC gene and the clinicopathological significance in rectal carcinoma among different ethnic groups in Xinjiang region.

　　Key words: 　rectal cancer; adenomatous polyposis coli gene; gene mutation; Polerase chain reactionSingle strand conformational polymohism;clinicopathology

　　直肠癌系消化系统常见恶性肿瘤,但确切病因和发病机理未明，目前,多认为结、直肠癌的发生涉及多基因、多步骤及多次打击的复杂过程,涉及多个癌基因激活和抑癌基因的失活[1]。近年研究提示APC基因突变在结、直肠癌中起始动和促进作用，但不同研究者报道之突变率存在较大差异。本研究应用聚合酶链反应单链构象多肽性(Polerase chain reactionSingle strand conformational polymohism，PCRSSCP)法检测新疆地区维吾尔族、汉族直肠癌患者癌组织与正常大肠粘膜组织中APC基因MCR的突变情况，旨在初步探讨APC基因突变在新疆不同民族直肠癌发生中的意义及其突变率是否存在民族差异及与临床病理的关系。

　　1材料和方法

　　1.1材料标本均取自新疆医科大学附属肿瘤医院腹外科2007年12月～2008年9月期间手术切除的原发性直肠癌病例,共70例,同时取距癌缘近端10 cm以外之正常大肠粘膜组织, 均经病理检查证实。患者年龄26～79 岁,中位年龄60 岁,维吾尔族∶汉族为4∶66，男∶女为36∶34。患者术前均未经放疗、化疗及生物治疗。标本离体后,立即取癌组织及正常粘膜组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小各2份,1份用无菌生理盐水冲洗,于-80℃冻存,严格按照上海生工临床样品DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取0.1 μg 用于PCR;另1份用10%中性甲醛液固定、石蜡包埋,切片后行HE染色行病理检查。原发肿瘤的大小、大体类型、浸润深度、淋巴结转移情况依据病理报告。组织学分型依据《中国常见恶性肿瘤诊治规范》第3分册《大肠癌》标准进行。大肠癌组织学分级采用Broder 分级法。大肠癌临床病理分期采用改良Duke′s分期法。

　　1.2聚合酶链反应单链构象多态性分析(RCRSSCP)

　　1.2.1PCR引物参考文献[2]设计引物，由上海生物工程公司合成,引物序列见表1。表1APC基因引物序列及产物片断长度编号序列扩增长度

　　1.2.2PCR反应体系及条件反应体系为25 μl , 取DNA 模板100 ng, 加入PCR Master(上海生物工程公司)12.5 μl;上、下游引物各0.8 μl;双蒸水补总体积至25 μl。反应条件：95℃预变性 5 min，94℃变性45 s, 于上表退火温度复性45 s, 72℃45 s, PCR仪(Gene cycler TM, BIORAD)内共35 次循环, 最后72 ℃再延伸7 min。

　　1.2.3PCR 产物鉴定取PCR 产物4 μl，于2%琼脂糖凝胶(加有0.5 mg/L溴乙淀)80 V电泳45 min后,凝胶成像仪检测。

　　1.2.4单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)SSCP 电泳槽缓冲液为0.5×TBE，BIORAD普通垂直电泳仪电泳。取PCR 产物 2 μl 加入4倍体积上样缓冲液(含95%的去离子甲酰胺, 20 mM EDTA，0.25%的溴酚蓝, 0.25%二甲苯菁)于0.2 ml EP 管,瞬时离心混合后97℃ 变性10 min,冰上淬冷10 min 后上样于已预电流30 min的8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(10 cm×10.5 cm,0.75 mm厚;丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)加样孔,250 V电泳5 min后，置于4℃冰箱，3 W电泳3 h，银染观察,银染方法参照文献[3]。结果判读：若同时电泳的肿瘤标本与相应正常大肠粘膜组织相比出现条带的增多、减少或有迁移变位的单链,即视为基因有突变。

　　1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件包处理资料数据,fisher 确切概率法采用stata 8.0处理，组间比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1APC基因SSCP电泳结果70例直肠癌中38例SSCP电泳出现异常带型,其中A引物扩增段异常带型7例;B引物扩增段异常带型8例;C引物扩增段异常带型18例,D引物扩增段异常带型12例。其中有6例出现两段及以上APC基因突变，包括A、B扩增段;A、C扩增段;C、D扩增段;B、C扩增段;A、D扩增段及B、C、D扩增段各1例。凡出现异常带型者，可间接反应出APC基因序列中核苷酸出现突变。异常带型如图1所示。

　　图1APC基因SSCP电泳图注：　箭头所指为突变带;　T电泳带为肿瘤组织;　N电泳带为正常粘膜组织2.2APC基因突变与民族及临床病理之间的关系70例直肠癌组织中APC基因突变38例(占54.3%)，APC基因在新疆地区维吾尔族、汉族直肠癌组织中突变频率较高，分别为53.6%和57.1%，但APC突变率与两民族之间及各临床病理因素之间差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。表170例直肠癌APC基因MCR突变与临床

　　侵润肠壁全层492551.00.7020.402未侵及肠壁全层211361.9注: *为确切概率P值3讨论结肠腺瘤性息肉病基因(APC)是第一个被发现在家族性及偶发性结、直肠癌中均有突变的基因，它定位于5q21,其编码的APC蛋白能与多种功能不同的蛋白质相互作用，如βcatenine、GSK3β、microtubule等，同时参与wnt等细胞信号通路的调节，可通过诱导凋亡和调节细胞的黏附功能、细胞周期、细胞迁移发挥作用[4]。APC基因生殖细胞突变是大肠腺瘤性息肉病(FAP)的分子病理基础,而体细胞突变对散发性结直肠癌起重要作用[5]，其大部分的遗传突变是无义突变，散在于羧基端，编码截短蛋白，只在几个特定位点有“热点”突变。大于60%的体细胞突变,即密码子12861513之间,该区域被称为MCR[6]。1989 年, 日本Orita 等[7]研究发现, 单链DNA 片段呈复杂的空间折叠构象,这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的, 当有碱基发生改变时, 会或多或少地影响其空间构象,使构象发生改变, 从而空间构象有差异的单链DNA 分子在非变性聚丙烯酰胺凝胶中受到的阻力不同,导致电泳速度不同，经染色后就可以在凝胶上面检测出结果, 因此称该方法为单链构象多态性(SSCP)分析。SSCP技术不能指出具体的突变位置和突变类型,但简单、快速、灵敏度较高，理论上可以检出0.2%个碱基突变(500个碱基中的1个碱基)，Hayashi[8]经实验证明小于300 bp的DNA片段中的单碱基突变, 99%可通过SSCP 发现, 对于300～450 bp片段的灵敏度为89%。特别适用于流行病学的早期筛检和诊断。本研究采用PCRSSCP 法检测直肠癌组织及及正常大肠粘膜组织中APC基因突变密集区碱基突变, 结果显示70例直肠癌组织中APC基因突变率为54.3%，与王艳等[9]报道的APC基因突变范围(20.0%～60.0%)相符，提示APC基因突变与新疆直肠癌的发病存在一定相关性，但APC基因突变与民族、临床病理特征及Duke′s分期无关(P>0.05),初步证实APC突变可能亦无种族差异性，属于直肠癌发生的早期分子事件。因本次研究中两民族之间样本含量相差较大，在今后研究中可适当增加维吾尔族样本量，增强可比性，同时结合DNA直接测序进一步分析APC基因突变类型，进一步证实两民族之间APC基因突变位点和序列是否存在差异。

　　【参考文献】

　　[1]Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis[J].Cell,1990,61(5):759767.

　　[2]詹俊, 李新,于钟 等. 粪、血APC 及Kras 基因突变联合检测在大肠癌筛查中的作用[J]. 南方医科大学学报, 2007,27(7):10181021.

　　[3]Benbouza H, Jacquemin JM. Optimization of a reliable, fast, cheap and sensitive silver staining method to detect SSR markers in polyacrylamide gels[J]. Biotechnol Agron Soc Environ, 2006,10(2):7781.

　　[4]Munemitsu S, Souza B, Muller O, et al. The APC gene product associates with microtubules in vivo and promotes their assembly in vitro[J]. Cancer Res,1994,54(14):36763681.

　　[5]Miyoshi Y, Nagase H, Ando H, et al. Somatic mutation of the APC gene in colorectal tumors: mutation cluster region in the APC gene [J]. Hum Mol Genet, 1992,1(4):229233.

　　[6]詹启敏.分子肿瘤学[M].北京:人民卫生出版社,2005：70180.

　　[7]Orita M, Iwahana H, Kanazawa K, et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as singlestrand conformation polymorphisms[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:27662770.

　　[8]Hayashi K. PCRSSCP: a method for detection of mutations [J].Getet Anal Tech Appl, 1992, 9(3)：7379.

　　[9]王艳，刘士良，郝冬梅,等. 聚合酶链式反应单链构象多态性分析法检测大肠腺瘤及大肠癌APC基因突变[J].中华肿瘤杂志，1998,20(4)：284286.