应用组织芯片研究乳腺癌组织中CK5／6蛋白的表达及其临床意义

　　作者：毕晓峰,高纪东,宣立学,张保宁　　作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院腹部外科, 北京 100021

　　【摘要】目的 探讨乳腺癌组织中CK5/6蛋白的表达与临床及预后的关系。方法 制作240例乳腺癌组织芯片,采用免疫组织化学法检测乳腺癌组织中CK5/6蛋白的表达,分析其与乳腺癌临床病理特征及预后的关系。结果 CK5/6阳性表达占乳腺癌总数的14.72%(29/197)。CK5/6表达与患者年龄、月经、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤病理类型等无关,而与ER阴性表达具有相关性(P<0.01)。CK5/6表达阳性与阴性的乳腺癌比较,生存期短且预后差。结论 CK5/6阳性表达的乳腺癌患者预后较差,CK5/6可成为乳腺癌预后的指标之一。

　　【关键词】 乳腺肿瘤,组织芯片,免疫组织化学; CK5/6

　　To explore the expression of CK5/6 in breast cancer. Methods The expression of CK5/6 in 240 breast carcinomas samples was determined by immunohistochemistry with tissue microarray (TMA). Results Positive expression ratio of CK5/6 in breast cancer was 14.72%(29/197). CK5/6 expression was not correlated with age, menses, size of tumor, clinical TNM stage, auxiliary lymph nodes metastasis, or pathologic type(P>0.05)but was correlated with negative expression of ER; Patients with negative CK5/6 expression survived longer than those with positive expression(P<0.01). Conclusions Positive expression of CK5/6 can result in poor prognosis and it may be one of markers to evaluate the prognosis of breast cancer.

　　Key words: Breast carcinoma; Tissue microarray; Immunohistochemistry; CK5/6 乳腺癌是一类分子水平上高度异质性的疾病,组织学形态相同的肿瘤,其分子遗传学改变不尽一致,导致肿瘤治疗反应和预后的差异。单纯依靠普通病理形态学的研究已不适宜肿瘤学的研究,迫切需要应用分子技术对肿瘤发生发展的病理学机制及生物学行为加以认识,为肿瘤分类提供更多的信息,为肿瘤的预后和治疗决策提供更有利的证据。肿瘤分子分型(molecular classification)的目的是通过综合的分子分析技术为肿瘤分类提供更多的信息。CK5/6作为分子分型中basallike表型乳腺癌的特征性标志物[1],目前国内对其与乳腺癌的临床病理特征及预后的相关性研究较少。为此,本研究构建了乳腺癌组织芯片,检测240例乳腺癌患者肿瘤组织中CK5/6的表达,以确定CK5/6在乳腺癌组织中的表达，并探讨其临床意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 临床资料 收集中国医学科学院肿瘤医院腹部外科2000年手术切除的乳腺癌石蜡标本240例(经过查阅病历记录,因时间较长,部分资料有缺失)。患者均为女性,29～80岁,平均50.92岁。其中绝经前136例,绝经后104例。浸润性导管癌190例,浸润性小叶癌10例,导管内癌5例,其他类型癌14例。临床分期0期6例,Ⅰ期57例,Ⅱ期108例,Ⅲ期62例。有淋巴结转移113例,无淋巴结转移116例。平均生存期65.81个月,中位生存期72个月。

　　1.2 方法

　　1.2.1 制作组织芯片 ①调阅HE切片于显微镜下标记癌巢。借助HE切片于供体蜡块的相应部位进行标记作为取材部位;②将普通病理石蜡熔化,沉淀3次,加入3%精制蜂蜡,制作4.0?cm×2.0?cm×1.0?cm 大小的空白蜡块;③组织芯片的设计和制备:设计12×12点组织列阵,用打孔机制成模块,用直径0.6?mm的打孔针从供体蜡块的选定部位逐个取出组织芯,每个标本共取组织芯三处,随即放入预先设计的阵列模块中,排列成组织芯片模块,置于60?℃温箱中50?min。将制成模块常规切成4?μm的切片裱于硅化玻片上,60?℃温箱过夜[2]。

　　1.2.2 免疫组化试剂来源及方法 CK5/6鼠抗人单克隆抗体浓缩液,免疫组织化学PV9000通用型二步法检测试剂盒,二氨基联苯胺(DAB)试剂盒均购自北京中杉生物技术公司。抗体工作浓度1:20,按照试剂盒操作步骤,切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后,高温抗原热修复后进行染色;DAB显色,出现棕黄色阳性信号后即刻终止反应;自来水流水冲洗,苏木素对比染色,中性树胶封固。每次实验均以已知阳性组织切片为阳性对照,以PBS缓冲液为一抗作阴性对照。

　　1.3 阳性结果判定 CK5/6表达于乳腺上皮细胞膜和细胞质(部分肌上皮细胞可表现为不连续细胞的胞质染色,不计入结果)。抗体染色评定标准: (-)为<5%的上皮细胞阳性;(+

　　2 结 果

　　2.1 CK5/6在乳腺癌组织中的表达 240例组织标本中,共统计有价值的组织标本197例。除表达强度为阴性外均统计入阳性表达组。结果阳性表达为29例(14.72%),阴性表达为168例(85.28%),见图1。图1 CK5/6在乳腺癌组织中的阳性表达(SP染色)

　　A×100, B×400,(+2.2 CK5/6表达与乳腺癌临床病理特征的相关性 通过比较CK5/6表达与各临床病理特征,可见CK5/6阳性表达与ER阴性表达具有明显相关性(P<0.01),而与其他指标如年龄、月经情况、肿瘤大小、淋巴结转移情况、临床分期、病理类型、HER2、PR无明显相关性(P>0.05)，见表1。 表1 CK5/6表达与乳腺癌临床病理特征的相关性

　　CK5/6阳性29/197CK5/6阴性168/197χ2P 年龄(岁)〖4〗0.2940.588 ≤351/1110/11 >3528/186158/186肿瘤大小(cm)〖4〗0.5600.906 ≤210/7565/75 2～516/10387/103 ≥52/119/11Her2〖4〗0.9940.803 -11/7362/73 +17/11396/113PR〖4〗5.3480.148 -14/8167/81 +14/10995/109 ER〖4〗8.2100.004 -21/9574/95 +7/9588/95淋巴结情况〖4〗1.1830.757 N012/9179/91 N1(1～3)8/4739/47 N2(4～9)6/3024/30 N3(≥10)2/1816/18月经情况〖4〗0.1170.449 绝经前18/11698/116 绝经后11/8069/80TNM分期〖4〗1.9930.574 0/44/4 Ⅰ期4/4137/41 Ⅱ期15/9681/96 Ⅲ期9/5041/50病理类型〖4〗2.3420.504 浸润性导管癌27/175148/175 浸润性小叶癌1/76/7 原位癌0/33/3 其他0/1010/10

　　2.3 CK5/6表达与患者预后的相关性 KaplanMeier生存分析显示,CK5/6表达阳性组的平均生存期为66.04个月;CK5/6表达阴性组的平均生存期为83.14个月。Log Rank值=5.217,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

　　3 讨 论

　　Perou等[3]于2000年首次应用基因芯片检测了65例乳腺肿瘤标本,并结合患者的预后进行聚类分析,认为依据基因表达类型可将乳腺癌分为basallike、luminal、Her2+和normal 4种类型。随后以更大样本量进行研究得到的结果进一步证实了以上的分类。目前多数研究者认为,4种类型中basallike和HER2+两型预后较差[46]。其中basallike表型乳腺癌以其独特的基因表达模式、较差的预后引起研究者的广泛兴趣。

　　CK5/6蛋白的表达是确定basallike表型乳腺癌的一个重要指标。目前对于该型乳腺癌的免疫组织化学表现,大多数研究者认为需要ER、PR和Her2三者均阴性,同时需表达基底细胞型细胞角蛋白,包括CK5、CK14或CK17,并把它们作为鉴定basallike表型乳腺癌的金标准[7]。也有研究者采用ER、Her2二联阴性,与一种基底细胞型细胞角蛋白阳性(CK5、CK5/6、CK14 或CK17) 作为鉴定basallike表型乳腺癌的标准,也得到了认同[8]。而研究病例最多的是采用单一CK5/6阳性作为标准,且有多项研究表明,CK5/6是乳腺癌独立的预后指标[9]。

　　目前国内外的研究表明,细胞角蛋白(CKs)的阳性表达已经成为上皮细胞及其肿瘤细胞较为敏感和特异的指标。该家族由分子量不等的20个成员组成,即CK1～20。一般在上皮组织中成对表达,特异性强。有报道乳腺癌患者外周血中CK5/6/18阳性细胞的表达与乳腺癌的分期有关,并可作为临床监测和判断预后的参考指标[10]。

　　本研究应用组织芯片技术检测乳腺癌组织中CK5/6的表达,分析其与临床病理特征的关系,结果显示其与患者年龄、月经、肿瘤大小,TNM分期、淋巴结转移情况、肿瘤病理类型等无关,但与患者雌激素受体的阴性表达具有显著相关性(P<0.01)。本研究结果表明,CK5/6的表达与三阴性乳腺癌为显著正相关(r=0.176,P=0.005),因此依据ER、PR、HER2阴性并且CK5/6阳性的判定标准考虑可将CK5/6的阳性表达作为判断basallike表型乳腺癌的单一指标。经过KaplanMeier生存分析发现患者CK5/6阳性表达组的预后明显较差,差异具有统计学意义(P<0.05),因此CK5/6可成为评价乳腺癌患者预后的重要指标之一。

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