PPH治疗环状内痔82例体会

　　作者：邓华瑜,罗红霞,范维珂　　作者单位：重庆医科大学病理生理学教研室,重庆

　　提　要:目的　研究HSP90的表达与乳腺癌细胞侵袭转移能力的相关性。方法　采用RT-PCR和Western blot检测

　　HSP90在MDA-MB-435s和MDA-MB-231细胞中mRNA水平和蛋白质水平的表达差异。Transwell小室人工重组基底膜侵袭迁移实验检测经HSP90抑制剂Geldanamycin(GA)处理前后两株细胞侵袭迁移能力的改变。结果　MDA-MB-435s细胞中HSP90α的mRNA表达水平明显高于MDA-MB-231细胞(P<0. 01), MDA-MB-435s和MDA-MB-231细胞中HSP90β的mRNA表达水平没有明显差异(P>0. 05), MDA-MB-435s细胞中HSP90的蛋白质表达水平明显高于MDA-MB-231细胞(P<0. 01)。两株细胞用药前侵袭迁移能力无明显差异(P>0. 05),HSP90的抑制剂GA对MDA-MB-435s和MDA-MB-231细胞的侵袭迁移能力均呈现明显抑制作用(P<0. 01,P<0. 05),对MDA-MB-435s细胞的抑制作用更明显(P<0•01)。结论　HSP90的表达影响乳腺癌细胞侵袭转移能力。

　　关键词:乳腺癌细胞株,HSP90,侵袭转移

　　Abstract:Objective　To investigate the correlation between theHSP90 expression and invasion andmetastasis potential ofhuman breastcancer cell line.Methods　ThemRNA expression levelofHSP90wasdetected by RT-PCR. The protein expression level ofHSP90 was measured byWestern blotting. The effects ofHSP90 inhibitorGeldanamycin(GA)on the invasion and motility abilities of human breast cancer lineMDAMB-231 andMDA-MB-435sin vitrowere explored by transwell chamber.Results　ThemRNA expression level ofHSP90αinMDA-MB-435s cellwas higher than hat ofMDA-MB-231 cell(P<0. 01). The mRNA ex-pression levelofHSP90βhad no difference(P>0. 05)between the two cell lines. The protein expression levelofHSP90 inMDA-MB-435s cellwas higher than thatofMDA-MB-231 cell(P<0. 01). The invasive andme-tastatic potential in human breastcancer cellMDA-MB-435s andMDA-MB-231 had no difference(P>0. 05).After treated with GA,the invasive and metastatic potential in human breast cancer cellMDA-MB-435s andMDA-MB-231 was suppressed significantly(P<0. 01,P<0. 05),but the effects ofHSP90 inhibitorGA on in-vasive andmetastatic potentialofMDA-MB-435s cellwasmore significant than thatofMDA-MB-231 cell(P<0. 01).Conclusion　The abilities of invasion andmetastasis ofbreastcancer cells are related to the expressionofHSP90.

　　Key words:breast cancer line;HSP90;metastasis

　　乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,转移扩散是其预后不良的重要原因,一些乳腺癌患者局部肿瘤控制多年后,仍可发生血行转移[1]。热休克蛋白(heatshock protein,HSP)90是一种重要的分子伴侣[2],近年来研究表明它可与乳腺癌细胞中的一些信号分子和激酶结合形成复合物,从而可以参与调控乳腺癌的侵袭转移能力。本研究采用RT-PCR和Western blot技术以及Transwell小室人工重组基底膜侵袭、运动实验探讨HSP90的表达对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响。

　　1　材料与方法

　　1. 1　材料与细胞株

　　乳腺癌细胞系:MDA-MB-435s、MDA-MB-231由重庆医科大学外科教研室惠赠;提取RNA用Trizol试剂盒购于PRO-

　　MEGA公司;RT-PCR试剂盒RNA PCR KIT(AMV)VER. 3. 0购于TaKaRa公司;HSP90α、HSP90β和GAPDH引物序列由博雅

　　公司合成;用于Western杂交的兔抗人HSP90多克隆抗体(一抗)购于博士得公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(二

　　抗)购自北京中山公司;Geldanamycin(GA)购自ALEXIS公司;重组人工基底膜Matrigel购自美国BD公司;TranswellChamber(8μm孔径)购自美国Costar公司; RPMI-1640培养基购自GIBCO公司;新生小牛血清购自TED公司。

　　1. 2　方法

　　1. 2. 1　细胞培养　　人乳腺癌细胞MDA-MB-435s、MDA-MB-231接种于含10%小牛血清, pH 7. 4的RPMI1640培养基中,置37℃, 5% CO2培养箱中培养,至对数生长期进行实验。

　　1. 2. 2　RT-PCR　　GAPDH引物序列:上游引物5′-GAAGGT-GAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物5′-GAAGATGGT GATGG-

　　GATTTC-3′; HSP90α引物序列:上游引物5′-AAACACCTG-GAGATAAACCC-3′,下游引物5′-GTATCATCAGCAGTAGGGT-

　　CA-3′; HSP90β引物序列:上游引物5′-CAAGATCAGCGAGGC-CGA-3′,下游引物5′-CCCTTGGGACCCTGAGC-3′。GAPDH扩增片段长度为225碱基对(base pair, bp);HSP90α扩增片段长度为230 bp;HSP90β扩增片段长度为120 bp。

　　总RNA的提取按RNA提取试剂盒说明进行;反转录按RT-PCR操作试剂盒说明进行。反转录反应体系为MgCl22μ,l

　　10(RT Buffer1μ,l Rnase Free dH2O 3. 75μ,l dNTPMixture(各10 mmol/L) 1μ,l Rnase Inhibitor 0. 25μ,l Reverse Transcriptase0. 5μ,l Oligo dT-Adaptor Primer 0. 5μ,l乳腺癌细胞TotalRNA(1μg/μl) 1μ,l总反应体系为10μl。反转录反应条件: 30℃10 min, 50℃30 min, 99℃5 min, 5℃5 min, 1个循环。PCR的反应体系: 5×PCR Buffer 10μ,l灭菌水28. 75μ,l TaKaRa ExTaqTMHS 0. 25μ,l上游引物0. 5μ,l下游引物0. 5μ,l cDNA 10μ,l共50μl。HSP90α和HSP90β的反应条件: 95℃5min预变性; 94℃30 s, 57℃30 s, 72℃5 min, 35个循环。取PCR扩增产物5μl上样于1. 7%琼脂糖凝胶(含0. 5 mg/ml的溴乙锭),120 V电压电泳30 min,然后将凝胶放入凝胶电泳成像仪,在紫外光下自显影,经计算机扫描成像。分别测定每一个目的基因及GAPDH基因吸光度值(D值),取目的基因与GAPDH基因吸光度值的比值进行分析。

　　1. 2. 3　Western blot　　取106个乳腺癌细胞加细胞裂解液RI-PA(TritonX-100,去氧胆酸钠,NP-40,偏钒酸钠, EDTA, EGTA, 1×PBS,Aprotine等)1 ml和PMSF 10μl裂解30 min, 4℃离心(2 000 r/min, 30 min)后取上清。然后加入1/5体积的5×上样缓冲液经沸水煮沸5 min处理后以20μl/道上样进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移至PVDF膜, 37℃封闭过夜,加入1∶500稀释的兔抗人HSP90多克隆抗体37℃孵育2h, PBS清洗3次, 10 min/次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG孵育2 h,清洗3次后在DAB溶液中显色。结果用凝胶成像仪扫描,以QuantityOne4. 4. 0软件分析,得到对照组与实验组HSP显色D值。

　　1. 2. 4　侵袭实验　　实验分两组,对照组:不加药,每天换RP-MI1640培养液;实验组:细胞进入对数生长期后开始加药,用分别为含16. 0 nmol/L和27. 2 nmol/L的中效浓度GA培养液分别培养MDA-MB-435s和MDA-MB-231细胞72 h后用于实验,每24小时换液以维持药物浓度。

　　制备趋化因子:用含10%的小牛血清的RPMI1640液培养NIH3T3细胞(100ml培养瓶), 37℃, 5% CO2,饱和湿度,当细胞达80%饱和度时用生理盐水洗3次,然后加无血清RPMI1640液3 ml培养24 h后收集上清液,离心, -20℃保存备用。

　　将Matrigel按40μl/孔均匀铺在Transwell Chamber膜上,成胶30 min后置紫外灯下照射过夜,实验前30 min再次成胶。　　取对照组和实验组细胞各2. 0×105个(RPMI1640液0. 6ml)分别接种到成胶的Transwell Chamber,在6孔板内加入NIH3T3细胞上清液(趋化因子),每孔1. 5 m,l培养48 h后取出TranswellChamber,用棉签头擦掉atrige,l PBS液洗3次,95%乙醇固定15 min,HE染色,揭下TranswellChamber膜反贴在载玻片上。结果判定: 400倍光镜下随机计数5个视野的穿膜细胞数,取均值。实验重复3次。

　　1. 3　统计学处理

　　数据以-x±s表示,利用SAS 8. 0软件进行t检验。

　　2　结果

　　2. 1　乳腺癌细胞株HSP90mRNA的表达情况

　　MDA-MB-435s(0.58±0. 04)细胞中HSP90α的mRNA表达水平明显高于MDA-MB-231(0. 39±0. 05)细胞(P<0. 01),MDA-MB-435s(0.41±0. 06)和MDA-MB-231(0. 39±0. 08)细胞中HSP90β的mRNA表达水平没有明显差异(P>0.05)。

　　2. 2　乳腺癌细胞株HSP90蛋白质的表达情况

　　MDA-MB-435s(0. 61±0. 11)细胞中HSP90的蛋白质表达水平明显高于MDA-MB-231(0. 28±0. 06)细胞(P<0. 01)。

　　3　讨论

　　HSP90是细胞内最丰富的蛋白质之一,可占细胞质内溶解蛋白质总量的1% ~2%[2]。根据是否含有丰富的谷氨酰胺片段, HSP90可分为HSP90α和HSP90β两种类型[3]。研究已经证实二者的同源性为76%[4],HSP90α基因位于14号染色体上[5],HSP90β基因位于6号染色体上[6]。研究表明在肿瘤细胞中HSP90的组成型表达比正常细胞高出2~10倍[7],许多病毒转化和化学诱导的肿瘤细胞中可明显看到HSP90α水平上升趋势,如胰腺癌中HSP90α呈选择性的高表达,细胞中存在大量的HSP90αmRNA,而HSP90β却为组成型表达。

　　HSP90是分子伴侣家族中一组较为独特的蛋白质,它除了作为分子伴侣参与蛋白质的折叠、运输和合成过程以外,还能和一系列参与肿瘤发生发展的信号转导系统中的激酶分子和突变蛋白质相结合,并调节它们的稳定性,从而影响多种信号转导途径的作用。目前发现能与HSP90相结合的底物蛋白已超过100种[8]。因此,HSP90在肿瘤研究领域已受到广泛关注。近年来Rousseau等[9]发现HSP90被抑制后可以抑制肿瘤细胞的血管生成和移动;Webb等[10]发现

　　HSP90被抑制后可抑制HGF/SFMET信号通路,使细胞的运动能力和侵袭能力减弱。

　　苯醌安莎霉素类抗生素geldanamycin(GA)及其衍生物17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔得霉素(17-allylamio-17-desmethoxygel-danamycin, 17-AAG)可以抑制HSP90的功能,研究证实GA的安莎环可以插入HSP90肽链的N端的ADP/ATP结合部位,抑制HSP90的弱ATP酶活性,妨碍其分子伴侣功能的发挥[11]。目前这类抗生素正被研发作为一种新的抗癌药物, GA抑制HSP90功能的明确构效关系为探究HSP90的作用和作用机制提供了有力的手段。

　　本研究以高转移能力的乳腺癌细胞株MDA-MB-435s和MDA-MB-231为实验对象,利用RT-PCR和Wester-blot技术检测了两株细胞中HSP90表达的差异,利用GA进行干预探讨HSP90与乳腺癌细胞侵袭转移能力的相关性。研究结果显示,两株细胞中,HSP90的表达存在一定的差异,MDA-MB-435s细胞中HSP90表达水平明显高于MDA-MB-231细胞,其HSP90水平表达增高与HSP90αmRNA水平增高呈一致趋势。利用HSP90抑制剂GA进行干预发现, GA可以抑制两株细胞的侵袭转移能力,但抑制的程度并不相同,对MDA-MB-435s细胞的侵袭转移能力的抑制作用更加明显。这与MDA-MB-435s细胞中HSP90高表达的结果相一致。由此说明HSP90的表达、可能是HSP90α的表达与乳腺癌细胞的侵袭转移能力具有一定的相关性,在HSP90高表达的细胞株中,HSP90对侵袭转移能力的调控有重要作用。

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