Rho A蛋白通路在DLC1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

　　作者：吴平平,苏昀,金治　　作者单位：1. 东南大学附属中大医院肿瘤内科,江苏南京 210009; 2. 东南大学附属中大医院 泌尿外科,江苏 南京 210009; 3. 东南大学基础医学院病理学与病理生理学系,江苏南京

　　【摘要】 目的： 探讨Rho A蛋白通路在DLC1(frequently deleted in liver cancer1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制。方法： 构建pcDNA3.1DLC1质粒载体，脂质体法转染HT29细胞，筛选稳定细胞系; pulldown方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布。结果： 野生型人结肠癌HT29细胞DLC1基因表达呈阴性，经转染获得DLC1稳定表达细胞系。与野生型及空载组HT29细胞相比，转染组细胞Rho A蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调， p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加，而G2期细胞数下降。结论： 转染DLC1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调，进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡，同时分裂前期细胞数减少，细胞增殖受抑。

　　【关键词】 肝癌缺失基因1, Rho A蛋白,Cyclin D1基因; p21基因; 细胞周期; HT29细胞株

　　肝癌缺失基因1(frequently deleted in liver cancer1，DLC1)，位于人类染色体8p21.322，是一个新的候选抑癌基因。1998年Yuan等[1]首先从原发性肝癌组织中分离出来，并认为该基因改变是肝癌发生的早期事件之一。随后，人们发现DLC1基因在大多数肿瘤中表达下降或缺失，体内外试验也证明DLC1蛋白可抑制多种肿瘤细胞生长和致瘤性[23]。目前的研究认为，DLC1基因的Rho GAP(Rho GTPase activating protein)结构域主要作用于Rho家族蛋白中的Rho A蛋白，对其进行负性调节，可能是DLC1基因抗肿瘤的主要机制。本课题组前期研究结果表明，人结肠癌HT29细胞株DLC1基因表达沉默[4]。故本实验以该细胞作为靶细胞,通过脂质体转染DLC1基因使其在HT29细胞株恢复表达，观察Rho A蛋白通路变化及其对细胞周期的影响，以探讨DLC1抑癌作用的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　结直肠癌HT29细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所;RPMI 1640培养基购自Gibco公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物技术公司;G418购自Sigma公司;原核细胞表达载体pCMVSPORT6(Amp抗

　　性)购自RZPD公司;Trizol细胞裂解液、脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;plasmid Midi Kit 购自QIAGEN公司;限制性核酸内切酶Xba Ⅰ、BamH Ⅰ，真核细胞表达载体pcDNA3.1，半定量RTPCR及SYBR Premix Ex TaqTM实时定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司;引物由TaKaRa公司合成。Rho A鼠抗人单克隆抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司。其他试剂及实验所需仪器由东南大学医学院发育与疾病相关基因教育部重点实验室提供。

　　1.2 pcDNA3.1DLC1质粒的构建

　　以Xba Ⅰ和BamH Ⅰ 酶切鉴定载体pcDNA3.1。合成带有Xba Ⅰ和Bam HⅠ酶切位点的引物，上游序列：5′CTAGTCTAGATGTGCAGAAAGAAGCCGGACACCATGATCCTAACACAAATTGAAGCCAAGGAAGC3′(下划线为Xba Ⅰ酶切位点)，下游序列：5′CGCGGATCCTCACCTAGATTTGGTGTCTTTG3′(下划线为BamH Ⅰ酶切位点)。PCR扩增获得DLC1基因全长cDNA，酶切消化DLC1基因PCR目的片段。DLC1基因目的片段PCR产物连接入载体pcDNA3.1。1.3 脂质体法转染HT29细胞以及筛选稳定的细胞系

　　转染前1 d，换取新鲜含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，于 37 ℃、5% CO2 孵箱中培养，调整浓度为2×105 ml-1，以每孔2 ml接种于6孔培养板中培养。待细胞增至70%时，将重组pcDNA3.1DLC1质粒和pcDNA3.1空载质粒转染HT29细胞，质粒脂质体复合物(质粒∶脂质体= 1∶3)转染至细胞中，4 h 后弃去转染液，换新鲜培养液继续培养1 d，再弃去培养液，用含G418(400 μg•ml-1)的1640培养液进行筛选，14 d后收集G418 抗性细胞，用于实验。实验分为对照组(野生型HT29细胞)、空白载体组(pcDNA3.1HT29细胞)和转染组(pcDNA3.1DLC1HT29细胞)。

　　1.4 Rho A蛋白活性检测

　　采用pulldown方法[5]提取细胞中以GTP结合形式存在的活性Rho A蛋白，继而进行蛋白免疫印迹(Western blotting)分析。10%聚丙烯酰胺行SDSPAGE电泳，而后将凝胶上的蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h，Rho A蛋白一抗(1∶200稀释) 4 ℃孵育过夜。洗涤后使其与二抗为HRP标记的兔抗小鼠IgG(1∶2 500稀释)作用，经ECL底物化学发光显影。

　　1.5 半定量RTPCR及实时定量RTPCR

　　Trizol一步法提取细胞总RNA，定量后取2 μg RNA 进行逆转录(reverse transcription, RT)反应。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)检测DLC1基因表达，反应条件为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环;72 ℃延伸7 min，终产物用1.5%的琼脂糖进行电泳鉴定。实时定量PCR检测Cyclin D1 及p21基因表达(ABI 7300 Thermocycler)，依照SYBR Premix Ex TaqTM kit说明进行，结果用2ΔΔCT法分析[6]。所用引物序列见表1。

　　1.6 细胞周期检测

　　收集各组细胞，PBS洗涤，2 000 r•min-1离心5 min，重复3次，调整细胞浓度为1×106 ml-1。将细胞悬液滴入2 ml预冷的70%乙醇中，-20 ℃固定24 h以上，加RNase至终质量浓度为1 mg•ml-1，37 ℃温浴30 min。加入碘化丙啶(PI)至50 μg•ml-1，1 h内以流式细胞仪(BD公司)测定细胞周期。

　　1.7 统计学处理

　　实验数据采用SPSS 11.0 统计软件进行析因、相关性分析。计数资料用Nonparametric Tests 中的Independent Samples过程，计量资料用Compare Means 中的OneWay ANOVA过程。表1 引物序列及反应条件

　　2 结 果

　　2.1 脂质体法转染DLC1基因后，HT29细胞DLC1基因恢复表达

　　分别提取对照组(野生型HT29细胞)、空白载体组(pcDNA3.1HT29)和转染组(pCDNADLC1HT29)细胞RNA，RTPCR检测DLC1 mRNA表达，结果显示，转染pCDNADLC1质粒后，HT29细胞DLC1 mRNA恢复表达(图1)。

　　2.2 转染DLC1对HT29细胞Rho A蛋白活性的影响

　　pulldown 方法结果所示(图2)，与对照组、空载组相比，转染组HT29细胞活性Rho A 蛋白表达降低，而总Rho A蛋白表达不变。通过总Rho A表达量来校正，以活性Rho A与总Rho A的比值进行分析，差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　2.3 转染DLC1对HT29细胞Cyclin D1及p21基因表达的影响

　　Realtime PCR结果显示，转染DLC1基因后，HT29细胞Cyclin D1基因表达较对照组和空载组下降(图3A)，而p21基因表达则上调(图3B)，差异具有统计学意义(P<0.05)。　△空载组与对照组HT29细胞相比，P>0.05;*转染组

　　2.4 转染DLC1对HT29细胞周期分布的影响

　　HT29细胞株经流式细胞仪检测细胞周期，结果见表2。转染组与对照组、空载组细胞相比，G1期细胞数及凋亡细胞数上升，而分裂前期G2期细胞数下降(P<0.05)，提示转染DLC1基因使G1期阻滞并诱导凋亡，同时细胞分裂受抑。表2 转染DLC1基因对HT29细胞周期的影响

　　3 讨 论

　　目前，DLC1基因的抑癌功能已经明确，本课题组在结肠癌LoVo细胞中的研究结果也证实，通过RNAi抑制DLC1的表达，促进LoVo细胞的增殖及侵袭，并引起细胞周期重新分布[7]，但其作用机制尚不清晰。

　　DLC1基因cDNA 序列与鼠p122 Rho GAP 基因有着82%的同源性[1]，推测此结构域可能是DLC1基因抗肿瘤的主要机制。Rho蛋白GTP酶活化蛋白(Rho GAP)能提高Rho家族蛋白自身内源性的GTP酶活性，使GTP水解成GDP，从而使Rho家族蛋白由活性形式变为非活性的形式。Rho家族蛋白(其中最重要的是Rho A)是一类重要的分子开关，通过调节下游靶分子参与细胞增殖、凋亡、黏附、细胞骨架形成等多种生物学过程[8]。DLC1 基因沉默使Rho A蛋白得以活化，从而向细胞内持续传递生长信号，导致肿瘤发生，因此Rho A蛋白通路被认为与DLC1蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用有关。本实验中转染DLC1基因降低Rho A蛋白活性，进一步证实Rho A蛋白通路参与DLC1蛋白抗肿瘤的机制。

　　有研究表明，细胞周期相关蛋白受到Rho蛋白调控[9]，如在乳腺上皮细胞中，Rho A 蛋白通过EGF 和Ras 信号通路下调p21蛋白的表达，并增强Cyclin D1 启动子的活性，促进DNA 的合成[10]。Cyclin D1蛋白属于G1期细胞周期蛋白，可促使细胞越过控制点而完成G1/S转换使细胞增殖加快，促进细胞的增殖;p21WAF/CIP1基因是目前已知具有最广泛活性的细胞周期负调控因子，可使细胞停滞在G1 期而有利于细胞对损伤DNA 的修复或启动细胞凋亡程序清除受损细胞。本实验研究发现，转染DLC1基因后HT29细胞中的Cyclin D1表达下调，而p21WAF/ CIP1基因表达明显上调，流式细胞分析也表明，转染组HT29细胞G1期及凋亡细胞数增加，而G2期细胞数下降。推测Cyclin D1与p21表达的相对变化导致HT29细胞周期阻滞于G1期，并诱导凋亡，而活跃的分裂前期细胞数则下降，细胞增殖受抑。因此，DLC1可能通过降低Rho A 蛋白活性，进而影响细胞周期相关蛋白而对HT29细胞周期进行调控。

　　最新的一些结果表明，DLC1也可通过Rho GAP非依赖性机制抑制细胞生长[11]，它的另外两个主要结构域SAM(sterile alpha motif)[12]与START(steroidogenic acute regulatory related lipidtransfer)[13] 也参与调节细胞形变和运动。还有报道DLC1的作用需定位于黏着斑，与黏附分子家族成员tensin 相互作用[14]。因此，DLC1发挥抑癌作用的机制是相当复杂的，需要进一步深入研究。

　　总之，本实验结果证明转染DLC1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下降，进而可能通过对Cyclin Dl、p21表达的调控引起细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡，同时分裂前期细胞数减少，细胞增殖受抑。其中涉及的具体信号通路仍值得进一步探讨。

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