新辅助热化疗对乳腺癌微血管密度和血清VEGF的影响

　　作者：蒋金恒,包国强,何显力,高德明,马庆久　　作者单位：第四军医大学唐都医院普通外科，陕西 西安 710033

　　【摘要】目的: 研究新辅助热化疗对乳腺癌患者肿瘤微血管密度(MVD)、血清血管内皮细胞生长因子(VEGF)的影响. 方法： 应用免疫组织化学技术及酶联免疫吸附测定法(ELISA)，观察新辅助热化疗和新辅助化疗后肿瘤MVD的变化,检测乳腺癌患者接受新辅助热化疗和新辅助化疗前后血清VEGF含量. 结果： 新辅助化疗组与对照组相比，MVD明显下降[(47.4±13.3)个/HP vs (81.7±17.6)个/HP，P<0.05];新辅助热化疗组与新辅助化疗组及对照组相比，MVD下降更明显[(26.8±5.9)个/HP vs (47.4±13.3)个/HP及(81.7±17.6)个/HP，P<0.05]. 与对照组相比，新辅助化疗和新辅助热化疗后血清VEGF含量均明显降低[(315±154) ng/L vs (156±53) ng/L，P<0.05;(307±156) ng/L vs (140±47) ng/L，P<0.05];新辅助热化疗与新辅助化疗后VEGF含量变化两组间差异无统计学意义(P>0.05). 结论： 新辅助热化疗和新辅助化疗后乳腺癌患者MVD及血清VEGF水平均明显下降. 新辅助热化疗组较新辅助化疗组MVD下降更为明显.

　　【关键词】 乳腺肿瘤,化学疗法,辅助,肿瘤微血管密度;血管内皮细胞生长因子

　　0引言

　　肿瘤的生长、浸润、转移及复发与肿瘤血管形成密切相关[1]，肿瘤微血管密度(microvessel density, MVD)是衡量肿瘤血管形成程度的标志. 而血管内皮生长因子(vascuiar endotheliai cell growth factor，VEGF)在肿瘤血管形成中起重要作用[2]. 新辅助热化疗对乳腺癌患者血清VEGF含量与MVD的影响研究国内报道甚少. 我们通过检测乳腺癌患者新辅助热化疗、新辅助化疗前后血清VEGF及肿瘤组织MVD的变化，探讨新辅助热化疗对乳腺癌血管生成的影响及在乳腺癌临床治疗中的意义.

　　1材料和方法

　　1.1材料选择2004/2007经我院病理检查证实为晚期乳腺癌女性患者60例. 人VEGF ELISA试剂盒(森雄生物公司);CD34 mAb，免疫组化染色试剂盒，DAB染色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司).

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组按术前治疗方案不同分为对照组，新辅助化疗组和新辅助热化疗组，每组20例，三组患者临床病理资料无统计学差异(表1). ① 新辅助化疗组：术前行新辅助化疗方案，采用多烯紫杉醇+阿霉素+环磷酰胺方案，共完成2个周期治疗;② 新辅助热化疗组：术前行新辅助热化疗方案，其化疗方案同新辅助化疗组. 热疗采用脉冲聚焦微波加热治疗系统(南京启亚医疗设备有限公司，脉冲峰值功率6000～32 000 W，工作频率2.45 GHz，波长12 cm，温度控制范围(42.5±1.0)℃. 热化疗于化疗药物开始输注后0.5～1 h进行，每次热疗60 min. 化疗1个周期共联合2次热疗，共完成2个周期治疗;化疗方案及周期同第1组;③ 对照组术前不接受任何治疗.

　　1.2.2标本制作术中切取新鲜乳腺癌组织，甲醇固定，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，然后制成组织切片. 取外周静脉血3 mL(新辅助热化疗和新辅助化疗患者血清标本于第2疗程化疗结束后1 d抽取，对照组于术前1 d抽取). 室温自然凝固后，2000 r/min，离心10 min，分离血清，采集血清样本，置-20℃保存.表1乳腺癌3组临床病理资料

　　1.2.3组织MVD检测MVD采用免疫组化法检测，将所有待染石蜡切片，脱腊至水，PBS振洗3 min×3;30 mL/L H2O2去离子水封闭30 min. PBS振洗3 min×3;3 mol/L尿素消化30 min，柠檬酸修复，PBS振洗3 min×3;用滤纸将片子擦干后，置于湿盒内，37℃正常血清封闭30 min;滴加一抗(3 mg/L)，放入冰箱4℃过夜;d2，取出片子，37℃复温30 min，PBS振洗3 min×3;滴加二抗，37℃于湿盒内孵育30 min，PBS振洗3 min×3;滴加ABC复合物，37℃于湿盒内孵育30 min，PBS振洗3 min×3;DAB显色20 min，自来水充分冲洗，苏木素淡染，乙醇逐级脱水，透明，封片. 结果判定(微血管定量方法)参照Weiderner的方法，在100倍光镜下挑选微血管分布最密区域，200倍视野下计数5个不重复视野中被CD34染成棕色的血管数目，取其均值作为MVD. 微血管的判定不以是否形成管腔或管腔内有无红细胞为记数单位，而是以与邻近的微血管明显分离的染色阳性的单个内皮细胞簇均作为一个血管计数，凡管腔大于8个红细胞，带较厚肌层的血管均不计数.

　　1.2.4血清VEGF检测血清VEGF采用酶联免疫吸附测定法检测，VEGF含量的检测及结果计算按照VEGF ELISA试剂盒说明书进行.

　　统计学处理：应用SPSS11.0统计软件对数椐进行统计学分析，数据以x±s表示，分析采用t检验. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1组织MVD计数免疫组化CD34染色，显示三组乳腺癌组织切片中微血管均呈现不同程度的棕黄色(图1). MVD数值分别为(81.7±17.6)个/HP，(47.4±13.3)个/HP和(26.8±5.9)个/HP，组间差异有统计学意义(P<0.05).

　　2.2血清VEGF含量结果显示，血清VEGF含量对照组为(304±156) ng/L;新辅助化疗组化疗前为(315±154) ng/L，化疗后为(156±53) ng/L(P<0.05). 新辅助热化疗组在热化疗前为(307±156) ng/L;热化疗后为(140±47) ng/L，新辅助热化疗前血清VEGF的含量明显高于热化疗后血清VEGF的含量，差异具有统计学意义(P<0.05).

　　3讨论

　　乳腺癌新辅助化疗可以缩小肿瘤及淋巴结体积，使原发肿瘤及淋巴结降期，提高保乳率，改善癌旁浸润情况，降低癌细胞活力消灭微转移灶，提高可手术率，减少术中播散及术后转移，消灭亚临床病灶，减少复发的潜在危险. 肿瘤热疗是利用物理能量在组织中积聚而产生热效应,使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度,并维持一段时间,以杀死癌细胞,又不损伤正常细胞的一种治疗方法[2-3]. 肿瘤新辅助热化疗即化疗联合热疗,可能成为临床上一种新的肿瘤治疗的方法. 实体肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成，而MVD与肿瘤浸润、复发和转移等生物学特性密切相关. MVD可作为判断肿瘤预后的独立指标. VEGF为特异的血管内皮细胞刺激因子，能够促进内皮细胞的增殖、分裂，促进新的血管生成，同时可引起细胞外基质改变而有利干肿瘤细胞在合适的微环境形成新的转移灶[4-5].

　　我们检测新辅助化疗及新辅助热化疗前后的MVD值和血清VEGF含量，新辅助热化疗和新辅助化疗后患者MVD值和血清VEGF水平较化疗前显著下降，而新辅助热化疗较之新辅助化疗更能有效降低肿瘤血管密度及血清VEGF. 提示新辅助热化疗可能通过减少肿瘤的血管形成，破坏其血流供应而达到抑制肿瘤增殖、转移的作用. 其机制可能由于热化疗使肿瘤部位的热量蓄积, 局部温度高于周围正常组织温度, 使化疗药物的作用具有定向性. 热化疗可以使肿瘤血管内皮细胞间紧密连接增多，间隙减小，血管壁变厚;甚至可以导致新生血管只有完整的基膜而缺乏内皮细胞，通过抑制肿瘤细胞合成与分泌VEGF，从而减少VEGF对血管内皮细胞刺激所引起的血管过度增生[6]. 研究结果显示，新辅助热化疗可使乳腺癌MVD和血清VEGF含量下降，提示其在乳腺癌临床治疗中可能具有重要意义. 但新辅助热化疗目前仍处在未成熟的研究阶段,仍有大量问题有待于进一步深入研究和解决. 例如: 热疗的剂量学、深部精确无损测温、与化疗达到最大协同作用的间隔时间和次序等，这方面的研究报道还相对较少，相信随着临床研究的深入,肿瘤热化疗在肿瘤综合治疗中将会越来越显示出它的作用.

　　【参考文献】

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