Vcp mRNA在胃癌中表达的研究
发表时间：2012-02-01 浏览次数：527次
作者：聂鸿平,熊炳贤 作者单位：南昌大学医学院第二附属医院普外科， 江西 南昌 330006
【摘要】目的：研究Vcp mRNA表达与胃癌及淋巴结转移的关系，寻找术前预测淋巴结转移危险度及预后的标志基因。方法：采用RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳EB染色法，检测42例胃原发癌、正常黏膜、淋巴结转移癌中Vcp mRNA的表达。结果：Vcp mRNA在上述组织细胞中均有表达，胃原发癌和淋巴结转移癌明显高于正常黏膜(P<0.01)，且胃原发癌Vcp mRNA表达与转移淋巴结数量具有相关性。结论：胃原发癌Vcp mRNA过度表达的患者淋巴结转移范围及程度相对较重，癌细胞侵袭力较强，宜行扩大根治术;术前RT-PCR检测胃原发癌Vcp mRNA表达有助于确定治疗方案及判断预后。
【关键词】 胃癌,淋巴转移,Vcp mRNA
Abstract： Objective： To study the relationship between Vcp mRNA expression and gastric cancer and lymph node metastasis of gastric cancer, and to assess the significance of predicting the extent of lymph node metastasis and prognosis. Methods： Vcp mRNA expression was examined in matched primary lesions, normal gastric mucosa and lymph node metastatic lesions among 42 gastric cancer patients by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR), polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)and EB stain. Results： The primary tumor samples showed a significantly higher level of Vcp mRNA expression compared with matched normal tissue(P<0.01). The Vcp mRNA expression showed a low level in benign lesions. The Vcp mRNA expression showed a higher level in patients with the number of lymph node metastasis. Conclusion： The degree of lymph node metastasis and invasiveness of carcinoma cells are more serious in cases with Vcp mRNA overexpression, and extensive lymph node dissection should be carried out for these patients. Examination of Vcp mRNA expression by RT-PCR before surgery is indicated to estimate the prognosis.
Key words: gastric cancer; lymphatic metastasis; Vcp mRNA
胃癌是我国发病率和死亡率均占第一位的恶性肿瘤[1]，合理的胃癌根治术是治疗成功的关键之一，而癌肿的淋巴侵袭转移潜能是手术预后的关键因素，目前尚缺乏客观、有效的指标用于术前确定淋巴结转移范围和程度。因此，从分子水平深人研究胃癌淋巴转移规律，寻找淋巴转移的标志基因，具有十分重要的意义。为此，笔者研究了Vcp mRNA的表达与胃癌及淋巴结转移的关系，旨在寻找术前预测淋巴结转移危险度及预后的标志基因。
1 材料与方法
1.1 组织标本的来源 收集2007年3月至2007年9月南昌大学附属第二医院胃肠外科新鲜胃癌标本42例，各标本分成2部分，均经病理证实。其中男性25例,女性17例,患者术前均未行放疗和化疗，新鲜标本置液氮中30 min后转-70 ℃冻存。
1.2 总RNA提取及cDNA合成 用TRIzol试剂(Invitrogin公司产品)提取总RNA，按说明书进行，凝胶电泳测定浓度。采用AMV酶逆转录试剂盒(Promega公司产品)合成第一链cDNA，以总RNA 4 μl为模板，oligo(dT) 1 μl为引物(详细步骤见说明书)。
1.3 PCR扩增Vcp mRNA基因和内对照GAPDH基因 用Premier 5设计Vcp mRNA基因RT-PCR引物，上、下游引物分别为5′-GTCCTTGAATGAA3GTAGGGTAT-3′和5′-GTTGGGTCTGTTGGTYGC-3′，产物为466 bp;GAPDH基因上、下游引物分别为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3′和5′-GCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′，产物824 bp。取cDNA 4 μl进行扩增，94 ℃预变性2 min，经30个循环(变性94 ℃ 35 s、退火51 ℃ 35 s、延伸72 ℃ 65 s)，延伸72 ℃ 5 min，保温4 ℃，GAPDH基因退火温度为52 ℃。
1.4 电泳检测、扫描及半定量分析 产物行2%聚丙烯酰胺凝胶电泳EB染色检测。应用电泳凝胶成像分析软件landscan测定Vcp mRNA及GAPDH基因扩增条带平均灰度值(A)，计算Vcp mRNA表达指数(I)。I=Vcp mRNA/GAPDH基因。
1.5 统计学处理 对Vcp mRNA在不同组织中的表达采用配对均数t检验;其表达与临床病理因素的关系采用单因素方差分析，并进行均数两两比较。
2 结 果
2.1 Vcp mRNA在各配对部位的表达 Vcp mRNA在胃原发癌、正常黏膜、淋巴结转移癌中均有表达。42例患者中，Vcp mRNA阳性表达者原发癌38例(90.4%)，正常黏膜32例(76.2%)，淋巴结转移癌36例(85.7%)，Vcp mRNA在不同患者3个配对组织中的表达见图1。胃原发癌高于正常黏膜(P<0.01)，淋巴结转移癌明显高于正常黏膜(P<0.01);低于胃原发癌，但差异无统计学意义(P>0.05)。具体见表1表1 42例胃癌患者不同组织Vcp mRNA表达的配对情况表2 临床病理因素与胃癌组织中Vcp mRNA表达的相关性
2.2 Vcp mRNA在胃原发癌、淋巴结转移癌中的表达与临床病理因素的相关性 由表2可见，胃原发癌Vcp mRNA表达与转移淋巴结数量具有相关性，转移数量越多，其表达量越高(P<0.05);淋巴结转移癌的Vcp mRNA表达与胃原发癌中该基因表达具有一致性。
3 讨 论
众所周知，反映肿瘤-淋巴结-远隔转移情况的TNM系统对胃癌的临床治疗方案及预测胃癌的复发以及死亡具有重要意义[2，3] 。癌肿仅累及上皮黏膜的早期胃癌患者行切除术后预后较好，而对于已发生存在于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官播散的，无任何临床表现且常规临床检测又无法发现的单个肿瘤细胞团的微小转移患者，术后常预后差、复发率高[4，5]。因此，针对肿瘤转移、预后的研究对建立合理的治疗方案意义深远。
在过去研究中发现，Vcp蛋白为广泛存在于细胞内的蛋白之一，是与多种细胞活性相关的三磷酸腺苷酶超家族中的一员，是糖基磷脂酰肌醇连接的转铁蛋白同系物，通过与各种辅助因子结合形成大分子复合物，充当分子伴侣的作用，如与p47,Ufd1/Np14 结合形成的复合体与有丝分裂后的内质网、高尔基体、核包膜的膜融合密切相关[6]。已经证实，Vcp蛋白是通过激活NF-κB (nuclear factor kappa B)信号通路起调节作用，它与泛素蛋白的分解，特别是与转录因子NF-κB的抑制性inhibitor B的分解有关[7，8]。NF-κB可参与癌基因的活化及抑制肿瘤细胞的凋亡作用，与肿瘤的浸润、转移、免疫应答、凋亡等生物学行为关系密切[9]。 Vcp蛋白在DNA 损伤的修复、细胞周期的调节、抗调亡、应激、转录的调节、蛋白的降解等过程中担任重要的角色，以调控细胞的增殖和调亡。Yamamoto等在对肝癌[10]、食管癌[11]、结肠癌[12]的研究中观察到：Vcp蛋白表达和肿瘤大小、浸润深度、组织分化、脉管浸润及淋巴结转移相关。这些相关因子均与肿瘤的转移潜能具有直接联系。笔者在研究中发现，胃原发癌Vcp mRNA表达明显高于正常黏膜，并与转移淋巴结数量有相关， 淋巴结转移阳性个数大于15的胃癌患者全部侵袭了胃浆膜层，Vcp mRNA表达相对较高。同时淋巴结转移阳性个数大于15的胃癌原发灶与其他组差异有统计学意义(P<0.05)。提示，Vcp mRNA过度表达的胃癌患者，淋巴结转移范围较大，数量较多，癌细胞侵袭力较强，术后复发的可能性较大，宜行扩大根治术。因此，术前检测Vcp mRNA表达有助于确定治疗方案及判断预后。本组标本主要是中分化腺癌，淋巴结转移阳性个数大于15的胃癌原发灶Vcp mRNA表达明显高于其他组，与Yamamoto等的研究结果一致[10]。
Vcp蛋白是一个增殖因子，属ATP酶家族的一种，参与细胞抗凋亡活性的调控。Vcp蛋白的表达，NF-κB 的活性调节、细胞调亡的调控、肿瘤细胞的增殖之间的关系受哪些因子的调控，目前还不十分清楚。而Vcp mRNA是翻译Vcp蛋白的遗传编码基因，它的显性表达活性和隐性不表达状态以及在肿瘤的发生进展中受哪些因子的调控，还有待于进一步研究。
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