携带NK4与IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌的构建

　　作者：胡明泰,哈小琴,高鹏,吕同德,惠玲,昌业　　作者单位：兰州大学临床医学院,甘肃 兰州 730000, 兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃 兰州 730030, 甘肃省人民医院普外科，甘肃 兰州 730000

　　【摘要】目的：构建携带NK4基因和IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株. 方法： 用基因工程方法将NK4基因和IL2基因克隆入真核表达载体pcDNA4，并进行基因测序. 重组质粒经鉴定后再电转入减毒沙门氏菌Ty21a中，通过PCR和酶切鉴定，并对构建的重组减毒沙门氏菌进行体外稳定性观察. 结果： 经PCR和酶切证实，构建了分别含NK4基因和IL2基因的重组真核表达质粒pcDNA4NK4和pcDNA4IL2，并将他们成功导入减毒沙门氏菌Ty21a中. 稳定性实验结果表明该重组菌株在体外能稳定地繁殖、生长和传代. 结论: 成功构建携带NK4基因和IL2基因真核表达载体的减毒沙门氏菌株，为探索制备携带NK4和IL2基因的肿瘤减毒活疫苗奠定了基础.

　　【关键词】 NK4,基因,白细胞介素2;沙门菌属;疫苗，减毒

　　【Abstract】 AIM: To construct two recombinant attenuated Salmonella typhimurium strains carrying NK4 and IL2 gene eukaryotic expression vector. METHODS: NK4 gene and IL2 gene were obtained by PCR, then cloned into eukaryotic expression vector pcDNA4. The recombinants were identified, and transformed into attenuated Salmonella typhimurium strain Ty21a, and the clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. The stability of the two recombinant attenuated salmonella typhimurium strains was evaluated. RESULTS: Confirmed by PCR and restriction enzyme digestion, recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA4NK4 and plasmid pcDNA4IL2 were constructed successfully, and then introduced into an attenuated Salmonella typhimurium Ty21a. The recombinant strains stably reproduced, grew and passaged in vitro. CONCLUSION: The recombinant attenuated Salmonella typhimurium strains carrying plasmid pcDNA4NK4 and plasmid pcDNA4IL2 can be successfully constructed and identified, and it will help to develop a tumor expressing recombinant live vaccine carrying NK4 and IL2.

　　【Keywords】 NK4; genes; interleukin2; Salmonella; vaccines, attenuated

　　0 引言

　　肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是由间质细胞产生的多功能细胞因子，具有强促分裂、组织形成、诱导上皮细胞迁移，侵袭及诱导血管生成等作用,这些都有利于肿瘤组织的发生与发展[1]. 1997年Date等[2]用胰弹性蛋白酶对重组人HGF进行消化裂解，发现了一种新的全面拮抗HGF生物活性功能的拮抗剂NK4. NK4作为HGF的拮抗剂能显著抑制肿瘤细胞的生长、增殖和转移, 在肿瘤基因治疗中有潜在的应用前景.

　　白细胞介素2 (interleukin2, IL2)又称T细胞生长因子，是机体免疫调节中的重要细胞因子之一，可通过提高自然杀伤细胞与LAK细胞活性，增强细胞毒性T细胞(cytotoxic tlymphocyte, CTL)对肿瘤细胞的杀伤作用，并激活肿瘤侵润淋巴细胞从而诱导机体的抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长停止或瘤体减小[3]. 随着分子生物学的发展，IL2基因已经成为肿瘤基因治疗的热点. 其在乳腺癌和黑色素瘤的Ⅰ期临床实验中取得了明显的疗效[4]. 本实验我们将构建含NK4基因与IL2基因的重组真核表达载体(pcDNA4NK4和pcDNA4IL2),并将其导入减毒沙门氏菌Ty21a中，为其进一步应用提供实验依据.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 PCAGGS/hNK4质粒(美国Davis博士惠赠),PBV220IL2质粒(北京大学医学院惠赠)，减毒沙门氏菌菌株Ty21a(中国药品生物制品检定所),真核表达载体pcDNA4(本室保存),T4DNA连接酶、限制性内切酶ApaⅠ,BamHⅠ,EcoRⅠ,XhoⅠ,TaqDNA聚合酶,TVector均购自TakaRa公司. 质粒提取、凝胶回收试剂盒购自优晶生物工程公司. 酵母提取物、胰蛋白胨购自OXID公司. 其余试剂均为国产分析纯.电转仪(Eppendorf德国).

　　1.2 方法

　　1.2.1 pcDNA4NK4真核表达载体的构建 根据NK4基因序列，设计了引物. 引物1： 5′GGATCCGCCACCATGTGGGTGAC3′，引物2: 5′GGGCCCTCAGACTATTGTAGGTGT3′;以PCAGGS/hNK4质粒为模板,PCR扩增NK4基因cDNA. PCR参数为： 94℃ 30 s, 55℃ 30 s，72℃ 150 s，循环30次. PCR产物与T载体连接，转化JM109感受态，涂布于含XGal, IPTG, Amp的LB琼脂平板培养.挑取白色菌落，摇菌，提取质粒后鉴定. 将构建好的TNK4质粒及真核表达载体pcDNA4分别用ApaⅠ和BamHⅠ双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收凝胶中约1.4 Kb的NK4基因片段和线性化的pcDNA4，回收的NK4和pcDNA4以4∶1混合，加入T4连接酶，16℃连接12 h，连接产物转化感受态JM109细胞中，涂布于LB平板上，挑取单个菌落，摇菌，提取质粒后，双酶切鉴定.

　　1.2.2 pcDNA4IL2真核表达载体的构建 根据IL2基因序列，设计了引物. 引物1: 5′GAATTCCAATGTACAGGATGCACCTCC3′;引物2: 5′CTCGAGAGTTAGTGTTGAGATGATGCT3′，以PBV220IL2质粒为模板,PCR扩增IL2基因cDNA，PCR参数： 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30次， 72℃延伸7 min. PCR产物与T载体连接，转化感受态JM109，涂布于含XGal, IPTG, Amp的L琼脂平板培养. 挑取白色菌落，摇菌，提取质粒后鉴定. 将构建好的T IL2质粒及真核表达载体pcDNA4分别用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, 经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收凝胶中约490 bp的IL2基因片段和线性化的pcDNA4，回收的IL2和pcDNA4以4∶1混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接12 h，连接产物转化感受态JM109细胞中，涂布于LB平板上，挑取单个菌落，摇菌，提取质粒后，双酶切鉴定.

　　1.2.3 pcDNA4NK4和pcDNA4IL2重组质粒转化减毒沙门氏菌 将减毒沙门氏菌Ty21a菌种接种于5 mL LB液体培养基中，37℃ 200 r/min，振荡过夜. 取50 uL菌液，接种于50 mL LB液体培养基，振荡培养至A525 nm约0.6～0.7，4℃,4000 r/min离心10 min,2次. 最后悬浮于2 mL含100 mL/L甘油SOC培养基中. 将提取的质粒pcDNA4NK4及pcDNA4IL2各2 μL，分别加入200 μL菌液中，冰浴5 min然后移入电击杯中. 电转化条件： 2500 mV,放电时间0.5 ms. 电击后加入400 μL LB，37℃振荡45 min. 涂布在含氨苄青霉素的平板上.

　　1.2.4 重组减毒沙门氏菌的稳定性 将构建好的Ty21a/pcDNA4NK4和Ty21a/pcDNA4IL2在Amp(+)和Amp(-)的LB培养液中分别培养传代40次，每10代提取一次质粒，酶切鉴定.

　　2 结果

　　2.1 TNK4与TIL2的鉴定 提取并纯化质粒TNK4和TIL2，TNK4用ApaⅠ和BamHⅠ双酶切，ApaⅠ单酶切鉴定(图1). TIL2用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, EcoRⅠ单酶切鉴定(图2).

　　1: 2000 DNA Marker; 2: TNK4质粒; 3: ApaⅠ+BamHⅠ酶切; 4: ApaⅠ酶切.

　　图1 TNK4酶切鉴定(略)

　　1: 2000 DNA Marker; 2: TIL2质粒; 3: EcoRⅠ+XhoⅠ酶切; 4: EcoRⅠ酶切.

　　图2 TIL2酶切鉴定(略)

　　2.2 pcDNA4NK4和pcDNA4IL2的鉴定 提取并纯化质粒pcDNA4NK4和pcDNA4IL2，pcDNA4NK4用ApaⅠ和BamHⅠ双酶切，ApaⅠ单酶切鉴定(图3). pcDNA4IL2用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切, EcoRⅠ单酶切鉴定(图4).

　　2.3 重组减毒沙门氏菌的稳定性 将重组减毒沙门氏菌在Amp+和Amp-的LB琼脂平板上传代，每10代PCR检测目的基因，30代均可见扩出目的片段. 抽提重组菌质粒后，可见质粒不会因为无选择压力而丢失，且均能酶切出目的基因.

　　1: 2000 DNA Marker; 2: pcDNA4NK4质粒; 3: ApaⅠ+BamHⅠ酶切; 4: ApaⅠ酶切.

　　图3 pcDNA4NK4酶切鉴定(略)

　　1: 2000 DNA Marker; 2: pcDNA4IL2质粒; 3: EcoRⅠ+XhoⅠ酶切; 4: EcoRⅠ酶切.

　　图4 pcDNA4IL2酶切鉴定(略)

　　3 讨论

　　HGF是一种多功能细胞因子，可与肿瘤细胞表面的跨膜受体cMet蛋白结合，引起肿瘤细胞的浸润、转移，而且HGF可促进新生血管的生成. 如果用HGF拮抗剂将HGF促肿瘤增殖、扩散作用都阻断，无疑将起到抗肿瘤效果. NK4与cMet结合，可以竞争性地完全抑制HGF和cMet的相互作用，影响HGF/cMet系统的信号转导，从而抑制HGF所诱导细胞的增殖、运动和形态生成. NK4蛋白或NK4表达基因的注入，在各种不同类型肿瘤实验模型均能显示其抑制肿瘤侵袭、生长、转移、新生血管等作用[5-6]. Kuba等[5]的研究进一步证实，NK4在体外可抑制由碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子和HGF所诱导人微血管内皮细胞的增殖和迁移，从而认为NK4可通过抑制肿瘤血管的生成来控制肿瘤的进展.

　　采用细胞因子基因治疗肿瘤是近几年来兴起的具有巨大应用潜力的生物疗法. 而IL2单独或与其他细胞因子联合，是近几年抗肿瘤基因治疗研究中选用较多的细胞因子[7]. IL2主要由T细胞产生，其最重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖(G0期进入S期)和分化，并增强CTL的细胞毒活性，促进细胞移动，增强细胞间接触和诱导细胞分泌细胞因子IFNγ, TNF和IL4等.

　　对NK4和IL2的研究表明两者均有抗肿瘤活性，但是给药途径不理想. 减毒沙门氏菌具有直接抗瘤活性，并且具有靶向治疗载体的很多优点. Zheng等[8-9]应用减毒沙门氏菌做了临床前实验，将菌株通过静脉一次注射给多种荷瘤(鼠、人黑色素瘤，人结肠癌、肺癌、乳腺癌)小鼠，发现细菌聚集在肿瘤部位(包括转移瘤)是其他正常部位的200～1000倍. 以沙门氏菌作为基因传递载体有较多优势,如远距离注射可以靶向多种肿瘤;能在有氧及无氧的条件下生长，选择性地在肿瘤微环境中聚集;可以传递表达效应基因;具有高侵袭力和低致病性;可以通过口服给药，最终使细菌作用于远处肿瘤.具有游动性和均一的穿透性;可以表达多种治疗性蛋白;对组织有专一的趋向性;细菌影响到的组织通常是这些细菌的天然靶点;而且费用低，非侵袭性给药，适合长期治疗.

　　本实验构建了含NK4基因与IL2基因的重组真核表达载体(pcDNA4NK4和pcDNA4IL2),并将其导入减毒沙门氏菌Ty21a中. 以解决目前肿瘤基因治疗中存在的靶向性、有效性、可控性差等难题.

　　【参考文献】

　　[1] Zeng Q, Chen S, You Z, et al. Hepatocyte growth factor inhibits anoikis in head and neck squamous cell cancinoma cells by activation of ERK and AKt signaling independ of NKKB [J]. J Biol Chem, 2002,277(28):25203.

　　[2] Date K, Matsumoto K, Shimura H, et al. HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions for hepatocyte growth factor[J]. FEBS Lett, 1997,420(1):1-6.

　　[3] 孙 燕，张弘纲，彭 民, 等. 重组白细胞介素2治疗实体瘤及腹水Ⅲ期临床研究[J]. 中国新药杂志，1998，7(3)：171.

　　[4] Stewart AK, Lassam NJ, Quirt IC, et al. A denovectormediated gene delivery of interleukin2 in metastatic breast cancer and melanoma: Results of a phase 1 clinical trial[J].Gene Ther, 1999,6(3):350-363.

　　[5] Kuba K, Matsumoto K, Date K, et al. HGF/NK4, a fourkringle antagonist of hepatocyte growth factor is an angiogenesis inhibitor that suppresses tumor growth and metastasis in mice[J]. Cancer Res, 2000,60(23):6737-6743.

　　[6] Saga Y, Mizukami H, Suzuki M, et al. Expression of HGF/NK4 in ovarian cancer cells suppresses intraperitoneal dissemination and extends host survival[J]. Gene Ther, 2001,8(19):1450-1455.

　　[7] He P, Tang ZY, Ye SL, et al. The targeted expression of interleukin2 in human hepatocellular carcinoma cells[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2000,19(2):183-187.

　　[8] Zheng LM, Luo X, Feng M, et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumorselective protein delivery vector[J]. Oncol Res, 2000,12(3):127-135.

　　[9] Luo X, Li Z, Lin S, et al. Antitumor effect of VNP20009, an attenuated Salmonella, in murine tumor models[J]. Oncol Res, 2001,12(1112) :501-508.