抗凋亡基因Bag-1和Bcl-2在结肠癌组织的表达及相互关系的研究

　　作者：孙念峰,张建良,王国斌　　作者单位：1山东大学第二医院　普外科 2华中科技大学同济医学院附属协和医院　普外科

　　【摘要】目的：研究抗凋亡基因Bag-1和Bcl-2在结肠癌组织中的表达及意义，并探讨二者之间的关系。方法：应用免疫组织化学SABC法(链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法)对128例结肠癌组织及20例正常结肠组织中Bag-1和Bcl-2基因的表达进行检测。结果：Bag-1和Bcl-2在结肠癌中的表达与结肠癌病理类型、肿瘤直径、浸润深度及有无淋巴结转移无关，但Bag-1与病理分级、远处转移、Dukes分期及预后密切相关(P<0.05),而Bcl-2与这几项临床病理因素无明显相关性(P>0.05);Bag-1和Bcl-2在结肠癌的发生发展过程中呈正相关(r=0.475)。结论：结肠癌组织中有不同水平的Bag-1和Bcl-2蛋白的高表达，两者相互作用并可以作为结肠癌早期筛选的一项指标，对疾病的预后有重要意义。

　　【关键词】 大肠肿瘤,Bag-1,Bcl-2,细胞凋亡

　　【ABSTRACT】Objective: To investigate the expressions of Bag-1 and Bcl-2 in colorectal cancer and evaluate their clinical significance. Methods: Bag-1 and Bcl-2 expressions were studied by immunohistochemical Streptavidin-Biotin-Peroxidase Complex (SABC) method in 64 samples of colorectal cancer tissues, 10 normal colorectal tissues. Results: Bag-1 was positively related to the tumor grade, distant metastasis, stages of Dukes and prognosis, but was not related to the pathological cell types, tumor diameter, depth of invasion and lymph node metastasis. Bcl-2 was 　　结肠癌是人类胃肠道最常见的恶性肿瘤之一，且发病率有逐年上升的趋势。细胞凋亡障碍是肿瘤发生的重要机制之一，目前研究表明凋亡是一个受多基因控制的过程[1]。Bag-1是最近发现的一种多功能结合蛋白，具有与抗凋亡基因Bcl-2相互结合、相互影响从而促进细胞抗凋亡的能力[1-4]。Bag-1在肿瘤发生发展中的作用已成为国内外研究的热点问题之一。本研究采用免疫组织化学法检测Bag-1和Bcl-2在结肠癌组织中的表达情况，并就其临床意义及相互关系进行初步探讨。

　　1　资料与方法

　　1.1　一般资料　收集2004年1月—2007年12月手术切除的结肠癌石蜡包埋组织块128例，为华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科存档标本91例和山东大学第二附属医院病理科存档标本37例，均经4%多聚甲醛灌注固定，常规石蜡包埋连续切片，厚约5 μm。年龄37～74岁。按世界卫生组织(WHO)病理分级，腺癌92例(其中高分化腺癌36例，中分化36例，低分化20例)，黏液癌20例，未分化癌16例。按Dukes临床病理分期，A期44例，B期38例，C期28例，D期18例。同时选择20例正常结肠组织石蜡标本作为对照组。

　　1.2　实验试剂　主要试剂有兔抗人多克隆 Bag-1 抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗人Bcl-2抗体和链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)免疫试剂盒(北京中山生物制品公司)。

　　1.3　实验方法　采用常规SABC法(按试剂盒说明书方法)测定Bag-1和Bcl-2的表达， 抗Bag-1的工作浓度1：50，生物素化单抗和SABC试剂的工作浓度均为1：100。石蜡组织连续切片5 μm ，载玻片防脱片处理，常规脱蜡至水。石蜡切片经热抗原修复，滴加正常山羊血清封闭，室温20 min，滴加1：50抗Bag-1或Bcl-2抗体，4℃孵育过夜，次日滴加生物素化山羊抗兔IgG，20℃～37℃ 20 min，再滴加SABC试剂，20℃～37 ℃ 20 min，PBS清洗 5 min × 4次，3-3-二氨基联苯胺-4盐酸盐(DAB)室温显色20 min，苏木精复染，脱水，透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性反应片作阳性对照。

　　1.4　判定标准　Bag-1和Bcl-2皆以细胞质、细胞核棕黄色为阳性。随机观察5个视野，计算其平均数，每个视野计数100个细胞。Bag-1阳性细胞占肿瘤细胞数<10%为低表达(+)，10%～30%为中度表达(++)，>30%为高表达(+++);Bcl-2阳性细胞占肿瘤细胞数<30%为低表达(+)，30%～50%为中度表达(++)，>50%为高表达(+++)。

　　1.5　统计学方法　应用SPSS 10.0统计软件进行数据分析，阳性表达率比较用χ2检验，Bag-1与Bcl-2的关系采用相关系数(r)分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　Bag-1与Bcl-2在结肠癌组织表达

　　2.1.1　Bag-1的表达　Bag-1的免疫组织化学染色分为不表达、细胞质表达、细胞核表达和在二者同时表达4种形式。大部分表达在细胞核，小部分表达在细胞质，呈棕黄色颗粒，染色强弱不等。Bag-1在正常组织中阳性表达率为10%(2/20)，结肠癌组织的阳性表达率为64.1%(82/128)，二者差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

　　2.1.2　Bcl-2的表达　Bcl-2蛋白的表达部位主要在细胞核或细胞质，呈灶性或弥漫性分布。正常组织中Bcl-2蛋白阳性表达率为10%(2/20)，主要在细胞核呈灶性分布;结肠癌组织中Bcl-2蛋白表达阳性率为70.3%(90/128)，在细胞核或细胞浆内呈灶性或弥漫性分布(图2)。结肠癌组织中Bcl-2蛋白表达明显高于正常组织，二者差异具有统计学意义(P<0.05)。

　　2.1.3　Bag-1与Bcl-2的相互关系　结肠癌标本中Bag-1和Bcl-2均阳性表达54例，均阴性表达14例，对结肠癌标本中Bag-1与Bcl-2蛋白的平均阳性表达数进行分析，r=0.475，二者成正相关。

　　2.2　Bag-1和Bcl-2表达与结肠癌病理类型的关系　Bag-1蛋白在腺癌中阳性率为63.0%(58/92)，在黏液癌中阳性率为70.0%(14/20)，在未分化癌中阳性率为62.5%(10/16)，三者比较差异无统计学意义(P>0.05);Bcl-2蛋白在腺癌中阳性率为71.1%(64/92)，在黏液癌中阳性率为80.0%(16/20)，在未分化癌中阳性率为62.5%(10/16)，三者比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

　　2.3　Bag-1和Bcl-2的表达与结肠癌病理分级的关系　在高分化、中分化和低分化腺癌中Bag-1蛋白阳性表达率分别为33.3%(12/36)、77.8%(28/36)和90.0%(18/20)，三者之间比较差异有统计学意义(P<0.05);在相应的高、中、低分化腺癌标本中，Bcl-2的阳性表达率分别为72.2%(26/36)、83.3%(30/36)和80.0%(16/20),三者之间差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

　　2.4　Bag-1和Bcl-2的表达与结肠癌Dukes分期的关系　本研究结肠癌Dukes分期为A、 B、C和D期标本中Bag-1蛋白阳性表达率分别为27.2%(12/44)、73.7%(28/38)、85.7%(24/28)和100%(18/18)，各期间比较差异有统计学意义(P<0.05);在相应的各期标本中，Bcl-2的阳性表达率分别为68.18%(30/44)、68.42%(26/38)、71.42%(20/28)和77.78%(14/18)，三者之间差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

　　2.5　Bag-1和Bcl-2的表达与预后的关系　本研究患者均获随访，按5年生存率分组，术后存活超过5年84例，Bag-1蛋白在两组标本中的表达差异具有统计学意义(P<0.05);Bcl-2蛋白的表达与患者的预后无明显相关性(P>0.05，见表2)。

　　3　讨论

　　Bag-1基因是1995年首先报道的一种抗凋亡基因，其分泌蛋白是一种已经被确认的多功能结合蛋白，它不属于Bcl-2家族成员，但可与之相互结合、相互作用，增强其抗凋亡的能力[1-4]。Bag-1在正常组织中几乎不表达，而在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌及胃肠道恶性肿瘤中都有阳性表达[5-6]，Naishiro等[7]报道Bag-1能够促进胃癌细胞的远处转移。有研究表明在结肠癌标本中Bag-1细胞核表达阳性的患者其伴有远处转移的概率要高于胞核表达阴性的患者，且5年生存率要明显低于其他患者[8-9]。本研究表明Bag-1在结肠癌组织中阳性表达明显高于正常组织，且Bag-1蛋白在结肠癌细胞的细胞质和细胞核均阳性表达，可能与本研究所用的多克隆Bag-1抗体可以同时作用于存在于细胞质的短蛋白分子Bag-1S和存在于细胞核的长蛋白分子Bag-1L有关[8]。本研究还显示Bag-1的表达与结肠癌组织的细胞类型无关，与结肠癌的病理分级密切相关，病理分级越高，其阳性表达率也越高。Bag-1的表达在肿瘤的直径、浆膜浸润程度、淋巴结转移等临床病理因素方面差异无统计学意义，与肿瘤的Dukes分期、是否有远处转移及5年生存率呈明显相关，肿瘤的临床分期越晚，Bag-1表达阳性率越高，患者预后越差，说明Bag-1在肿瘤的发生发展分化过程中都起重要的作用，对Bag-1的深入研究可能对结肠癌的早期诊断及预后产生深远的影响。

　　Bcl-2是一种抗凋亡基因，通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发生，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤研究中Bcl-2与肿瘤的分级、分期及预后无关，但也有研究认为Bcl-2的表达与肿瘤的分级、分期及预后有关[10-12]，可能与应用不同的免疫组织化学方法、抗体及各地的实验室条件不同有关。本研究表明Bcl-2在影响结肠癌各种临床病理因素中阳性表达率都很高，提示Bcl-2的表达与结肠癌的各种临床病理因素没有明显相关性，Bcl-2可能参与结肠癌的发生过程，但与肿瘤的发展分化无明显相关性。

　　Bag-1基因是一个正调节Bcl-2抗细胞凋亡的蛋白，Bag-1基因并非Bcl-2家族成员的同源物，但其启动子区与Bcl-2具有高度同源性，两者可以形成复合物，并相互作用，从而增强细胞抗凋亡的能力，其作用机制可能与影响蛋白质的稳定性有关[3，10，12]。本研究发现在结肠癌组织中Bag-1与Bcl-2的阳性表达成正相关，提示结肠癌的发生发展是由多基因调控的，其中Bag-1与Bcl-2基因在其发病过程中发挥重要作用，且具有相互增强的作用。探索Bag-1与Bcl-2基因在结肠癌发生发展过程中的作用，对结肠癌的早期诊断和指导治疗有着重要的意义。

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