肿瘤抗原致敏DC诱导T淋巴细胞增殖及杀伤效率

　　作者：赵增仁,李勇,田延峰,张丽静,张峰　　作者单位：河北医科大学： 第一医院普通外科，河北 石家庄 050031, 第四医院普通外科，河北 石家庄 050011

　　【摘要】目的： 探讨胃癌细胞抗原致敏的树突状细胞(DC)诱导T淋巴细胞 (T lymphocyte) 增殖和杀伤胃癌细胞的效率. 方法： 应用淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞，经重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)、重组人白细胞介素4(rhIL4)和肿瘤坏死因子α(TNFα)，体外诱导培养获取成熟DC，流式细胞术检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表型;同时经重组人白细胞介素2(rhIL2)诱导扩增T淋巴细胞，检测CD3，CD4，CD8及CD56表型. 以人胃癌OCUM2MD3细胞株冻融抗原致敏DC，然后刺激T淋巴细胞，得到肿瘤抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(CTL). MTT法检测致敏DC对T淋巴细胞增殖的影响和致敏DC活化的特异性CTL对胃癌细胞的体外杀伤效率. 结果：体外诱导人外周血单个核细胞，可获得大量形态典型、具备强烈刺激增殖能力、且高表达CD80，CD86的DC及高表达CD3的T淋巴细胞;MTT法检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC组刺激T淋巴细胞增殖指数显著高于未致敏DC组和对照组(P<0.01);流式细胞术检测结果发现胃癌细胞抗原致敏DC主要刺激T淋巴细胞增殖为CD8+的CTL(60.58±8.43)%，经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后，对胃癌细胞的杀伤效应显著增加，致敏DC组对胃癌细胞杀伤活性(71.57±4.83)%，较未致敏DC组(12.53±1.62)%和单纯T淋巴细胞组(10.45±1.40)%作用更为显著(P<0.01),而且随着效靶比增加，其杀伤效应亦显著增加. 结论： 胃癌细胞抗原致敏DC可显著刺激T淋巴细胞增殖为CD8+ CTL，进而发挥其高效杀伤胃癌细胞的作用.

　　【关键词】 树突细胞,T淋巴细胞,胃肿瘤,T淋巴细胞，细胞毒性

　　0引言

　　树突状细胞(dendritic cells, DC)是专职的抗原提呈细胞，与机体抗肿瘤免疫关系密切[1]. DC加工处理提呈抗原信息后，通过激活T淋巴细胞而发挥抗肿瘤细胞的免疫效应. 研究[2]表明，各种人DC前体细胞如脐血、骨髓及外周血CD34+细胞或CD14+细胞等在联合应用GMCSF，IL4，TNFα等因子体外培养下，均可诱导成为成熟DC. 在多种肿瘤的临床试验中，发现DC免疫治疗具有一定的效果[3]. 我们以人外周血为DC来源，利用胃癌细胞冻融抗原致敏DC，观察其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphotytes，CTL)对胃癌细胞的杀伤效率，为DC治疗胃癌提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料人胃癌高侵袭OCUM2MD3细胞株，由日本大分医科大学外一科八代正和教授惠赠. 外周血取自健康志愿者. 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重组人白细胞介素4(rhIL4)，白细胞介素2(rhIL2)和重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)(美国Cytolab 公司);抗人CD3PE，CD4PE，CD8PE和CD56PE(美国Becton Dickinson公司);四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司);抗人CD83PC5，CD86PE，CD80FITC和HLADRFITC(美国BECKMAN COUNTER公司).

　　1.2方法

　　1.2.1DC分离培养及鉴定应用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞,以rhGMCSF和rhIL4诱导培养5 d后，加入TNFα，于第7日收集DC，光镜及电镜下观察其形态. 同时分别加入荧光标记的CD83PC5，CD80FITC，CD86PE和HLADRFITC，间接免疫荧光染色，采用文献[4]的方法，流式细胞仪检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表达.

　　1.2.2胃癌细胞冻融法制备抗原致敏DC胰蛋白酶消化、吹打收集对数生长期的人胃癌OCUM2MD3细胞，调整细胞数为2×107/mL. 将人胃癌OCUM2MD3细胞以液氮反复冻融法[5] 制备肿瘤抗原. DC培养至第5日加入胃癌细胞抗原，第7日加入TNFα，第8日收获胃癌OCUM2MD3细胞抗原致敏的DC.

　　1.2.3MTT法检测致敏DC诱导T淋巴细胞增殖将胃癌细胞抗原致敏DC,未致敏DC和T淋巴细胞，经60Co照射灭活，分别取1×103，3×103， 1×105接种于96孔培养板，分为致敏DC组、未致敏DC组和T细胞组. 每孔加入1×105 T淋巴细胞，终体积为200 μL. 混合培养96 h后，加入MTT溶液20 μL，继续静置培养4 h后，吸弃培养基，加入DMSO 150 μL，均匀震荡混匀10 min，自动酶标仪于波长492 nm处测定吸光度A值，空白培养基孔作为对照，按下面公式计算刺激增殖指数(SI). SI=各刺激组孔A492 nm /空白孔A492 nm.

　　1.2.4MTT法检测CTL对胃癌细胞的体外杀伤效应将负载胃癌抗原DC,未负载胃癌 抗原DC分别取2×104个细胞与T 淋巴细胞混合后及单纯T淋巴细胞置于48孔培养板上，分为致敏DC组、未致敏DC组、T细胞组，以人胃癌OCUM2MD3细胞为靶细胞，另设单独效应细胞组和单独靶细胞组. 按效靶比10∶1，20∶1，40∶1加入人胃癌OCUM2MD3细胞的培养液，静置培养24 h. 每孔加入MTT溶液200 μL，孵育4 h后全自动酶标仪于492 nm波长处测定A值. 杀伤活性按下式计算：杀伤活性(%)={1[(实验组A值-单独效应细胞组A值)/单独靶细胞A值]｝×100%.

　　1.2.5流式细胞术检测T淋巴细胞表型收集T淋巴细胞(T细胞组)和经胃癌细胞抗原致敏DC刺激扩增的T淋巴细胞(致敏DC组)，制备单细胞悬液，调整细胞数为5×106/mL，加入藻红蛋白标记的CD3，CD4，CD8及CD56荧光抗体孵育30 min后，流式细胞仪检测CD3，CD4，CD8及CD56的表达量.

　　统计学处理：数据结果以x±s表示，选用SPSS 11.5统计软件，采用t检验和方差分析进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1体外培养的DC形态人外周血单个核细胞经rhGMGSF, rhIL4联合诱导7 d后,光镜下观察细胞表面有毛刺状突起;扫描电镜(SEM) 观察DC表面粗糙，胞体向四周伸出大量树枝状或裙褶状不规则突起，有的突起末梢呈球状膨大，众多突起甚至遮盖了胞体，充分展示出DC的典型形态特征;透射电镜(TEM)下成熟DC的胞体较大，可见明显的突起, 胞浆细胞器较发达.

　　2.2DC细胞表型分析培养7 d时，收获的细胞以成熟DC为主. 流式细胞术检测DC表面CD83，CD80，CD86及HLADR表型，结果发现CD80，CD86的阳性细胞比率分别为(43.81±6.19)%和(51.07±4.32)%，CD83阳性细胞比率可达(61.94±5.87)%，HLADR达(72.26±7.65)% .

　　2.3T 淋巴细胞经胃癌细胞抗原致敏DC刺激前后改变获得T淋巴细胞于镜下观察可见细胞体积较小呈圆形，符合典型淋巴细胞的形态. 经胃癌细胞抗原致敏DC刺激后，T淋巴细胞形态无明显变化，数量明显增多，流式细胞术检测其CD3的表达率为(99.45±0.35)%.

　　A： 光镜下见DC表面有毛刺状突起×400; B： 扫描电镜下见DC表面有大量皱褶和树状突起×3500; C： 透射电镜下见DC表面有明显突起，胞浆细胞器较发达×3500.

　　2.4胃癌细胞抗原致敏DC对人外周血T淋巴细胞增殖的影响MTT检测结果显示，致敏DC组SI值为(57.3±11.5)%，显著高于未致敏DC组(18.3±7.4)%,T细胞组(18.5±2.6)%和对照组(17.6±5.3)%，差异具有统计学意义(P<0.01). 未致敏DC组、T细胞组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).

　　2.5胃癌细胞抗原致敏DC对T淋巴细胞表型的影响流式细胞术检测结果显示，T细胞组及致敏DC组的T淋巴细胞均高表达CD3，其阳性率分别为(99.45±0.35)%和(98.5±0.71)%;而致敏DC组的CD8阳性率(60.58±8.43)%显著高于T细胞组(32.52±4.09)%，差异有统计学意义 (P<0.01). CD4及CD56的阳性率差异无统计学意义(P>0.05).

　　2.6胃癌细胞抗原致敏DC诱导特异性CTL对胃癌细胞的体外杀伤效应经胃癌细胞抗原致敏DC诱导特异性CTL对胃癌细胞的杀伤效应显著增加，与未致敏DC组和对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，并且随效靶比增加，杀伤效应亦显著增加，未致敏DC组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05).

　　3讨论

　　DC作为机体内专职的抗原提呈细胞，在摄取、提呈抗原及激发后续特异性抗肿瘤免疫反应中发挥着不可替代的作用. 而在DC处理提呈抗原过程中，其表面分子CD80，CD86，HLADR的表达水平又起到重要的制约作用，直接关系到DC免疫激发的功能状态. 其中CD80，CD86作为DC激活T淋巴细胞过程中的重要共刺激分子作用尤为重要，其表达水平标志着DC免疫激活能力的高低[5-6]. 因此测定胃癌患者体内DC细胞表面分子的表达水平对正确判断患者预后及确定相应生物治疗方案有一定的参考价值. 我们以外周血单个核细胞作为DC来源，应用rhGMCSF+rhIL4+rhTNFα细胞因子组合，经7~8 d 培养，通过光镜和扫描电镜观察，细胞表面有大量皱襞和树状突起，证明获取到具有典型形态学特征的成熟DC，流式细胞仪分析显示其高表达CD80及CD86共刺激分子，表明DC具有高效激活T淋巴细胞的能力.

　　宿主攻击肿瘤依赖于特异性的抗肿瘤免疫，尤其是T细胞免疫. DC作为一专职抗原递呈细胞，能够诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫. 其抗肿瘤机制据认为是DC诱导的CTL对肿瘤细胞的细胞毒作用，其中CD8+ CTL可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫反应的主要环节. 研究表明T细胞功能与胃癌的发生发展密切相关，尤其CD4+，CD8+比数量关系更能反应宿主的细胞免疫状态和抗肿瘤能力[7]. 张坤等[8]采用细胞融合技术研究发现： SGC7901胃癌细胞DC融合疫苗激活T淋巴细胞可使其增殖能力明显增强. 我们用携带肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞增殖，发现其增殖能力也明显增强，检测其细胞表型发现T淋巴细胞主要增殖为CD8+ CTL，CD4及CD56无明显变化，说明肿瘤抗原DC主要通过刺激T淋巴细胞增殖为CD8+ CTL发挥抗瘤免疫功能.

　　研究发现，给予动物肿瘤相关多肽或蛋白致敏的DC不仅能诱导淋巴细胞特异性增殖，并且能产生针对肿瘤侵袭的防御保护能力[9-11]. 我们用携带胃癌抗原的DC刺激T淋巴细胞增殖产生的特异性CTL对肿瘤细胞有极强的杀伤活性，其杀伤率可高达(71.57±4.83)%，表现出明显的杀伤胃癌细胞的作用. 本实验结果充分表明胃癌抗原致敏DC可通过激活肿瘤特异性CTL而具有明显的抗肿瘤活性，为临床应用DC治疗胃癌提供了一定实验依据.

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